随着质谱技术的不断进步，大规模修饰组学的方法也越来越成熟，PTM作为生物体内非常重要的生理现象也逐步被揭示出参与各项生命活动。今天我们就一起来学习一篇运用质谱技术对磷酸化修饰和类泛素化修饰鉴定，找出两种修饰联合作用对在DNA复制损伤压力时的响应。该篇文献来自哥本哈根大学的研究人员于2017年10月发表在“cell report”杂志上的Proteomics Reveals Global Regulation of Protein SUMOylation by ATMand ATR Kinases during Replication Stress文献， 目的是通过质谱技术分析sumo化修饰和磷酸化修饰在细胞面对DNA复制压力时的信号传递、相互影响和关联的机制。

IF 8.282

课题背景

真核生物DNA复制是耗时且非常具有挑战性的过程，DNA复制的正常进行是维持正常细胞活动的基础，所以需要精准的保护机制来应对内外环境的波动，一旦保护机制失调导致基因组紊乱，甚至癌症的发生。大量报道显示，精密准确的翻译后修饰通过DNA损伤应答机制DDR（DNA damage response）为DNA复制保驾护航，其中依赖于磷酸化修饰的信号应答转过程的重要作用多为熟知。最近也陆续发现SUMO化修饰在该过程中也同样起到非常重要的作用。然而整体水平两种修饰在DNA复制损伤时的应答反应是否有相互影响，相互关联还鲜为人知。本文章的主题带着这样的疑问对两种大规模组学相互作用及关联展开了深入研究，探讨DNA损伤应答中两种组学的关系。

实验结论

分别对MMC刺激处理的稳转细胞进行SUMO化修饰和磷酸化修饰进行蛋白或者肽段富集，进行定性定量分析，后通过分析磷酸化修饰蛋白，SUMO修饰蛋白在表达量一致性，修饰蛋白种类重叠性，GO功能相似性放面的对比发现，发现在DDR发生过程中一些关键蛋白UIMC1，BRCA1等即发生SUMO化也发生了磷酸化。并通过大规模组学实验labelfree实验进行进一步对两种修饰的蛋白分析，发现在DNA损伤修复时，通过两种修饰的响应调控，形成相互作用的网络，共同应对外界损伤。 最后，通过DDR,RS响应的关键激酶ATR，ATM给药前后的的作用底物修饰分析验证，发现DNA损伤时ATR激活CHK1，使其发生磷酸化，且ATR的共同激活因子TOPBP1高度sumo化。进一步揭示了两种修饰作用的机制。

实验路线

建立flag-SUMO-2和his10- sumo-2-k0-Q87R稳转的U-2-OS细胞，并进行SILAC（稳定同位素标记）技术进行细胞培养。对该细胞使用胸苷阻断法细胞周期同步化24h后，给予MMC（丝裂霉素)给药和不给药刺激，制造细胞DNA损伤状态， 分别对阴性对照（未转染SUMO），SUMO稳转给药刺激和不给药刺激三种条件处理的细胞蛋白进行IP富集，通过高分辨质谱仪Q-Exactive high-frequency (HF)进行质谱分析，利用Maxquant软件对SUMO化蛋白和SUMO位点进行定性定量。其中值得一提的是，在SUMO化检测实验中，运用较经典的外源引入FLAG-SUMO2-Q87RSUMO蛋白的突变体方法来对SUMO化蛋白进行富集，并通过酶切之后的QQTGG和pyroQQTGG分子量偏移进行SUMO位点鉴定。共鉴定出3453个蛋白，其中702个显著变化的SUMO化蛋白。通过MMC刺激前后的稳转SUMO-2细胞中，发现有个187个SUMO蛋白是受MMC刺激变化显著上升的，SUMO位点共311个。

Sumo化蛋白功能分析

通过对187个MMC处理影响显著的sumo蛋白进行功能注释和互作网络分析发现，这些蛋白主要定位于细胞核中， 且主要与细胞修复相关。

磷酸化修饰分析

在磷酸化大规模修饰分析实验中，实验设计与SUMO化相同，技术路线上采用经典的磷酸化富集方法-TIO2，并且采用分级的方式提高磷酸化肽段的鉴定水平。通过该方法共鉴定到磷酸化位点20900个，其中650个磷酸化位点是受MMC处理显著上调的。通过GO分析也发现主要定位于细胞何种与DNA损伤修复相关，这与sumo的结果有惊人的相似度。

磷酸化和sumo化联合分析

为了说明磷酸化和sumo化之间有比较密切的联系，比较了这些受MMC影响的蛋白的定量水平的一致性，发现两种组学找到的差异蛋白的定量表达分布形态高度一致。

通过比较蛋白种类的重叠度，发现有540个蛋白同时发生了类泛素化和磷酸化，其中有17个蛋白是在MMC刺激之后两种修饰均上调的，其中包括已经报道的与DDR相关的关键蛋白，比如UIMC1，BRCA1等。

为了挖掘两种该修饰在DDR 和RS（replication stress）中的作用机制，进一步通过WB验证了在此过程中关键的蛋白激酶ATR，ATM的作用底物的磷酸化和SUMO化水平改变。通过DNA损伤刺激及ATR抑制剂处理前后相关激酶底物的SUMO化及磷酸化水平，证实关键激酶的激活是通过底物的磷酸化和SUMO等进行信号传递并形成相互影响。并且进行了补充label-free分析，对以上结论进行验证。

小编心得

该篇文献运用大量的质谱组学技术，对SUMO化，磷酸化在特定条件下进行了深入的定性定量研究，并进行关联分析，深入明确的阐述了DNA损伤时的两种修饰水平的改变及相互影响，是一篇非常典型的质谱应用的技术，其中不仅有修饰富集技术，还利用了普通labelfree技术，SILAC技术等等，这些都是现有质谱领域非常经典的方法，为大家做组学甚至是组学联合分析提供了一定的思路，非常值得大家借鉴和学习！

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