逆流色谱主要分为高速逆流色谱(HSCCC)和低速逆流色谱(SRCCC)，其中HSCCC已普遍应用于实验室中天然产物的分离。但由于其转速过快，仪器难以承受且安全性下降，因而HSCCC在较大规模的分离应用上难以推广。SRCCC不仅拥有HSCCC的众多优点，如无需采用任何固态的支撑体，不存在样品的不可逆吸附，样品损失小，溶剂消耗量小，经济有效，设备要求低和适应能力强，而且在进样量、分离效率和实验的安全性等方面有了进一步的提升，是较好的分离设备。特别是SRCCC采用的是低速运转方式(20-150 r/mill)，不容易造成机械部分的磨损和对引入引出管的损坏，在运行安全性上比HSCCC有了实质性的改进 。

分离柱由一根PTFE管绕制而成。主要包含六个部分:分离色谱柱、自动收机器、恒流泵、进样器、检测器以及试剂瓶。

由中国农业科学院茶叶研究所主持完成的"低速逆流色谱分离技术及其应用" 项目, 来源于1999 年浙江省科技厅重点项目(编号991102104), 经过两年实施, 超额完成了各项技术指标计划, 于2000年12 月30 日通过专家鉴定。该项目以V 型低速逆流色谱技术原理, 在国际上首次采用螺纹管作为逆流色谱柱管材, 使固定相保留率比标准直壁管显著提高, 解决了低速运转时固定相保留率低的问题, 同时还通过对管柱支持体直径、长度、柱转速与固定相保留率关系的研究, 确定了有利于固定相保留的最佳螺旋柱直径及常用溶剂系统的最佳转速。并根据研究得出的相关参数设计了一台世界上最大的逆流色谱仪(10 L 低速逆流色谱仪), 利用该仪器成功分离了葛根提取物中的葛根素、刺参提取物中的EPX 和茶提取物中的没食子儿茶素没食子酸酯, 三项分离技术已可直接应用于生产。通过应用证明,与国内外现有的高速逆流色谱仪和正交轴逆流色谱仪相比, 该仪器具有进样大、生产效率高、运行安全、造价低等优点, 是良好的制备型分离设备。经鉴定委员会专家认真评审后一致认为:该项目立题正确, 技术资料齐全, 数据可信, 研制的10 L低速逆流色谱仪及在EGCG 等天然产物分离中的应用有较高的学术水平、创新性和实用性, 其总体水平在同类研究中达国际先进水平 。

逆流色谱技术(Countercurrent Chromatography)，简称CCC，是20世纪70年代发展起来的一种液-液分配色谱新技术，可以在短时间内实现高效分离和制备。是新颖的分离技术它是不用任何固态支撑体的液液分配层析法，则能够完全排除支撑体导致的不可逆吸附和对样品的玷染、失活、变性等影响，能实现对复杂混合物中各组分的高纯度制备量分离。它同其它色谱技术的根本差别在于它不采用任何固相载体如柱填料吸附剂亲和剂板床筛膜等，从而完全排除了固相载体对样品的不可逆吸附污染变性失活等影响，并可以实现高纯净度高回收率高重现性以及超负荷大制备量的分离纯化。目前，逆流色谱技术已被广泛应用于医药、化工、食品、生物工程、有机合成、环境分析、地质、材料等领域，所涉及的分离对象包括植物、海洋生物、微生物发酵产物等材料中的生物活性组分，并已在稀土元素的分离方面取得了一些进展 。

将固定相快速泵入SRCCC的聚四氟乙烯(PTFE)管柱中,直至固定相充满整个分离柱。随后开动主机调节转速至50rpm,稳定后打开恒流泵,调节其流速至3.0mL/min。待只有流动相流出时表明柱内已达到流体动力学平衡。然后将己经溶解好的样品1.5g山进样器注射到进样管中,样品会在流动相的带动慢慢进入逆流色谱仪的主机。打开收集器,设置每管的收集时间,收集的组分经检测器进行分析,也可结合TLC或HPLC进行辅助分析,根据分析的结果进行分组分收集,待没有组分检出后停止分离 。

第1章 逆流色谱技术的发展概述 1

1.1 现代色谱技术的发展 1

1.2 液液色谱的起源 2

1.3 早期的逆流色谱装置(仪器) 3

1.4 高速逆流色谱的发展 4

1.5 高速逆流色谱的应用研究概况 5

参考文献 7

第2章 逆流色谱的技术原理 9

2.1 流体静力平衡体系(HSES) 9

2.1.1 基本模型 9

2.1.2 以HSES为基础的逆流色谱仪 10

2.2 流体动力平衡体系(HDES) 14

2.2.1 基本模型 14

2.2.2 以HDES为基础的逆流色谱仪 17

2.3 小结 22

参考文献 23

第3章 高速逆流色谱的技术原理 24

3.1 引言 24

3.2 单向性流体动力平衡逆流色谱原理 25

3.3 高速逆流色谱仪设计 26

3.4 Ⅳ型同步行星式运动加速度分析30

3.5 溶剂系统中两相在转动管柱里的流体动力学分布33

3.5.1 运动螺旋管里的流体动力学特征33

3.5.2 相分布图的研究34

3.5.3 影响相分布的各个物理参量36

参考文献40

第4章 正交轴逆流色谱仪41

4.1 仪器的设计原理41

4.2 正交轴仪器的同步行星式运动加速度分析44

4.2.1 作用于支持件中心平面上的加速度45

4.2.2 作用于支持件上任一点的加速度47

4.3 正交轴型仪器同轴螺旋管内相分布特性49

4.4 正交轴逆流色谱仪的操作条件优化54

4.5 正交轴型CPC的应用举例55

4.6 小结58

参考文献58

第5章 高速逆流色谱的特殊技术59

5.1 双向逆流色谱59

5.1.1 概述59

5.1.2 双向逆流色谱的原理和机制59

5.1.3 双向逆流色谱的应用61

5.2 泡沫逆流色谱法及其应用63

5.3 用在J型CPC上的螺线型固体圆盘柱组件系统64

5.4 pH?区带精制逆流色谱67

5.4.1 pH?区带精制逆流色谱的分离原理67

5.4.2 pH?区带精制逆流色谱的分类68

5.4.3 pH?区带精制逆流色谱分离的准备及操作69

5.4.4 pH?区带精制逆流色谱的优点和局限性71

5.4.5 典型pH?区带精制逆流色谱的应用72

5.4.6 亲和分离pH?区带精制逆流色谱的应用76

参考文献79

第6章 高速逆流色谱的工作方法81

6.1 HSCCC的溶剂系统选择81

6.1.1 HSCCC的溶剂系统的要求82

6.1.2 影响HSCCC分离的因素83

6.1.3 选择HSCCC的溶剂系统的步骤83

6.1.4 HSCCC的溶剂系统的选择方法83

6.1.5 一种实用的溶剂系统选择思路86

6.2 高速逆流色谱的工作步骤87

6.2.1 溶剂系统的准备87

6.2.2 柱系统的准备与运行87

6.2.3 样品溶液的制备和进样87

6.2.4 HSCCC分离和检测88

6.2.5 清洗分离柱90

6.2.6 注意事项90

参考文献91

第7章 HSCCC在天然植物有效成分分离中的应用93

7.1 生物碱类化合物的分离94

7.1.1 概述94

7.1.2 辣椒生物碱95

7.1.3 莲子心生物碱96

7.1.4 吴茱萸生物碱99

7.1.5 雷公藤生物碱 101

7.1.6 黄连生物碱 102

7.1.7 黄花乌头生物碱 105

7.1.8 夏天无生物碱 107

7.1.9 骆驼蓬生物碱 109

7.1. 10 防己生物碱 111

7.1. 11 苦参生物碱 111

7.1. 12 小结1 14

7.2 黄酮类化合物的分离1 15

7.2.1 概述1 15

7.2.2 橘皮黄酮1 16

7.2.3 牡丹花黄酮1 18

7.2.4 葛根黄酮 1 20

7.2.5 淫羊藿黄酮1 22

7.2.6 厚果鸡血藤异黄酮1 23

7.2.7 大豆异黄酮1 25

7.2.8 藤黄双黄酮1 27

7.2.9 黄芩黄酮1 28

7.2. 10 小结 130

7.3 植物多酚化合物的分离 131

7.3.1 概述 131

7.3.2 丁香多酚 132

7.3.3 金银花多酚 133

7.3.4 石榴多酚 137

7.3.5 菝葜多酚 138

7.3.6 紫锥菊多酚 140

7.3.7 茶叶多酚 143

7.3.8 花青素 145

7.3.9 小结 147

7.4 木脂素类化合物的分离 150

7.4.1 概述 150

7.4.2 厚朴木脂素 151

7.4.3 芝麻木脂素 152

7.4.4 五味子木脂素 154

7.4.5 丹参木脂素 158

7.4.6 牛蒡子木脂素 158

7.4.7 连翘木脂素 160

7.4.8 肉苁蓉木脂素 162

7.4.9 小结 165

7.5 香豆素类化合物的分离 166

7.5.1 概述 166

7.5.2 补骨脂香豆素 167

7.5.3 蛇床子香豆素 169

7.5.4 羌活香豆素 170

7.5.5 秦皮香豆素 172

7.5.6 白芷香豆素 173

7.5.7 盘龙参香豆素 177

7.5.8 小结 179

7.6 醌类化合物的分离 180

7.6.1 概述 180

7.6.2 紫草醌类化合物 181

7.6.3 大黄蒽醌化合物 182

7.6.4 虎杖醌类化合物 186

7.6.5 丹参醌类化合物 186

7.6.6 芦荟蒽醌化合物 190

7.6.7 何首乌蒽醌化合物 192

7.6.8 小结 194

7.7 萜类化合物的分离 194

7.7.1 概述 194

7.7.2 柿叶萜类化合物 195

7.7.3 雷公藤萜类化合物 196

7.7.4 甘草萜类化合物 198

7.7.5 穿心莲萜类化合物 199

7.7.6 甜瓜萜类化合物 201

7.7.7 番茄萜类化合物 201

7.7.8 银杏叶萜类化合物 204

7.7.9 冬凌草萜类化合物 204

7.7. 10 苹果皮萜类化合物 206

7.7. 11 赤芍萜类化合物 206

7.7. 12 栀子苷萜类化合物 207

7.7. 13 小结 2 10

7.8 皂苷类化合物的分离 2 10

7.8.1 概述 2 10

7.8.2 苦瓜皂苷 2 11

7.8.3 三七皂苷 2 12

7.8.4 人参皂苷 2 14

7.8.5 小结 2 16

7.9 其他类化合物的分离 2 17

7.9.1 当归内酯 2 18

7.9.2 太子参环肽 2 18

7.9.3 香附酮 2 20

7.9.4 葡萄籽脂肪酸 222

参考文献2 25

第8章 HSCCC在抗生素分离中的应用2 28

8.1 概述2 28

8.2 高速逆流色谱分离抗生素的实例 230

8.2.1 链孢毒素 230

8.2.2 环孢菌素 231

8.2.3 红霉素 232

8.2.4 螺旋霉素 234

8.2.5 抗真菌抗生素 236

8.3 小结 239

参考文献 239

第9章 HSCCC在海洋生物活性成分分离中的应用 241

9.1 概述 241

9.2 HSCCC分离海洋生物活性成分的应用实例 244

9.2.1 叶绿素 244

9.2.2 虾青素 244

9.2.3 叶黄素 246

9.2.4 斑蝥黄质 248

9.2.5 角鲨烯 250

9.2.6 苔藓虫素 251

9.2.7 聚醚类毒素 252

9.3 小结 253

参考文献 254

第 10章 逆流色谱在生物大分子分离中的应用 255

10.1 概述 255

10.2 双水相聚合物体系的构成与选择 257

10.3 制备分离应用举例 258

10.3.1 羊肚菌糖蛋白的分离 258

10.3.2 枸杞糖肽的分离 260

10.3.3 嘌呤核苷酸磷酸化酶的分离 260

10.3.4 卵白蛋白的分离 261

10.3.5 质粒DNA的分离 264

10.4 小结 265

参考文献 266

第 11章 HSCCC在无机离子分离中的应用 267

11.1 概述 267

11.2 DHDECMP逆流色谱体系 267

11.3 DCPDTPI的逆流色谱体系 268

11.4 TOPO逆流色谱体系 269

11.5 EHPA逆流色谱体系 270

11.6 DEHPA逆流色谱体系 271

11.7 B2EHP逆流色谱体系 272

11.8 DMDBDDEMA逆流色谱体系 272

11.9 Tetraoctylethylenediamine逆流色谱体系 273

参考文献 273

第 12章 HSCCC在生物医药产业中的应用及发展趋势 275

12.1 HSCCC在天然药用成分及标准样品制备中的应用 275

12.2 HSCCC在新药先导化合物的发现和筛选中的应用 279

12.3 高速逆流色谱指纹图谱 281

12.4 逆流色谱的发展趋势 284

12.4.1 逆流色谱药物的工业化放大 284

12.4.2 HSCCC的微型化及同多种分析技术的联用 284

12.4.3 HSCCC在生物大分子分离中的应用 285

12.4.4 逆流色谱技术应用领域的拓展 286

12.5 结束语 286

参考文献 287

附录HSCCC分离天然植物活性成分常用溶剂体系一览表 288

《高速逆流色谱技术》内容简介:高速逆流色谱技术因其结果物纯净、制备量大、技术成本低等优点正在发展成为一种备受关注的新型液?液分配色谱分离纯化技术，已经广泛应用于天然产物、生物医药、生命科学、农业食品、海洋生物、化工材料等广阔领域。《高速逆流色谱技术》详细介绍了逆流色谱技术的发展概况、技术原理，高速逆流色谱的技术原理、特殊技术、工作方法，正交轴逆流色谱仪，以及高速逆流色谱在天然植物有效成分分离、抗生素分离、海洋生物活性成分分离、生物大分子分离、无机离子分离、生物医药产业等中的应用。

可供天然产物、生物医药、生命科学、农业食品、化工材料等领域的研发人员、技术(分析、分离等)人员使用，也可供高等院校相关专业师生参考。

1.高速逆流色谱技术的原理

高速逆流色谱法是建立在单向性流体动力平衡体系之上的一种逆流色谱分离方法，它是在研究旋转管的流体动力平衡时偶然发现的。当螺旋管在慢速转动时，螺旋管中的两相都从一端分布到另一端。用某一相作移动相从一端向另一端洗脱时，另一相在螺旋管里的保留值大约50%，但这一保留量会随着移动相流速的增大而减小，使分离效率降低。但使螺旋管的转速加快时，两相的分布发生变化。当转速达到临界范围时，两相就会沿螺旋管长度完全分开，其中一相全部占据首端的一段，我们称这一相为首端相，另一段全部占据尾端的一段，称为尾端相。高速逆流色谱正是利用了两相的这种单向性分布特征，在高的螺旋管转动速下，如果从尾端送入首端相，它将穿过尾端相而移向首端，同样，如果从首端相送入尾相，它将穿过首端相而移向螺旋管的尾端。分离时，在螺旋管内首先注入其中的一相(固定相)，然后从合适的一端泵入移动相，让它载着样品在螺旋管中无限次的分配。仪器转速越快，固定相保留越多，分离效果越好，且大大地提高了分离速度，故称高速逆流色谱。

2.高速逆流色谱色谱仪的基本配置

仪器的中心部分:(a) ITO多层线圈分离柱，它是由100-200米长、内径为1.6mm左右的聚四氟乙烯管沿具有适当内径的内轴共绕十多层而成，其管内总体积可达300mL左右。(b)平衡器，它可以调节重量，它的作用是让(a)， (b)相对于中心轴两边重量平衡。当在旋转控制器的控制下，在齿轮传动装置作用下，(a)，(b)同时绕中心轴作顺时针或反时针的行星运动，即(a)- (b)本身既在自转，但同时又在绕中心轴公转，公转转速可从0-4000r/min。从线圈分离柱中通过中空的中心轴还同时牵引出了线圈的两端，一端供泵入液用，一端输出液体。仪器工作需要互不相溶的两种液体，一相作固定相，一相作移动相。仪器工作前，先将作为固定相一相的液体通过恒流泵压入线圈分离柱，然后用进样器将待分离的样品按如图所示进样，最后用恒流泵压入移动相，同时启动中心部分运转直到转速大于600r/min。此时，两相在线圈分离柱中具有相对运动之势。由于移动相源源不断的压入，阻止了固定相的流出，同时，移动相带着样品在线圈分离柱中进行无限次的分配而使复杂样品得到分离。当移动相经过检测器时，由于不同的样品组分会产生不同大小的信号，用记录仪就能得到逆流色谱图谱，同时用馏分收集器分步收集移动相就会得到复杂样品被分开的组分。较大的制备型HSCCC，柱容积可达530m1，一次最多进样可达20g粗品;较小的分析型的HSCCC柱容积为8m1，进样量为几十微克，最大转速可达4000r/min，分析能力堪与HPLC相媲美。

在常用的HSCCC基础上，有人提出双向模式的高速逆流色谱" (dua-mode counter crurrent chromatography简称Dccc)，即前一次的流动相作下一次的固定相，洗脱方向相反。与常规的HSCCC相比，Dccc可以降低制备时间，免去柱冲洗时间，提高分离效率，不必预测溶质的保留时间和分配系数，减少了溶剂选择的繁琐。但目前由于溶剂体系系统不完善，应用范围较窄。