活性氧正常代谢

体内正常代谢可以产生活性氧。线粒体是活性氧的一个重要来源，活性氧族如超氧阴离子自由基（O2-·）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH·）和单线态氧都是有氧代谢的副产物。在大多数细胞中超过90%的氧是在线粒体中消耗的，其中2%的氧在线粒体内膜和基质中被转变成为氧自由基。

体内的活性氧并不总是有害的，它对机体也有有利的一面。例如，机体内吞噬细胞在细胞膜受到刺激时，通过呼吸暴发机制，产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 是吞噬细胞发挥吞噬和杀伤作用的主要介质。但是在病理条件下，由于活性氧的产生和清除失去了正常平衡，常常会造成活性氧对人体的损伤。

活性氧辐射

人们很早就认识到辐射可以在体内产生活性氧。人体内的水约占体重的60%，放射线最初的作用就是使水辐射分解，产生H·OH·等，破坏细胞中的核酸、蛋白质等大分子，最终导致辐射病。T.Herrling 等人通过电子自旋共振（electron spin resonance，ESR） 的方法发现， 体外实验的皮肤细胞在紫外线的作用下可以产生氧自由基，并且这种辐射的效果与辐射强度和射线对皮肤的穿透作用的大小有关。

活性氧化学因素

许多化学药物如抗癌剂、抗生素、杀虫剂、麻醉剂、芳香烃类等都可以诱导产生活性氧。高压氧也可以诱导活性氧的产生。M.Chavko 和A.L.Harabin 对在5 个大气压下饲养的大鼠进行实验，可以检测到脂质和蛋白质的过氧化，同时还原型谷胱甘肽有下降的趋势，表明有氧化损伤的存在。另外，过渡金属离子对活性氧的形成很重要，这些离子去除电子的能力是形成和扩展许多毒性极大的活性氧反应的基础。最典型的例子就是铁催化的Fenton 型反应，即毒性较低的过氧化氢在过渡金属铁存在的情况下，生成活性极高的羟自由基，从而产生更大的毒害作用。

化学反应法

由于活性氧具有较高的反应活性, 它们可以与许多不同的化合物发生化学反应, 由此产生各种不同的反应生成物, 根据这些反应生成物或者反应物的变化程度可以进行定量或者定性分析。通常采用的仪器分析方法有, 化学发光法 、紫外-可见吸收分光光度法 、荧光光度法 、电子自旋探针 以及选择性电极法等。化学反应法的特点是测定灵敏度高、廉价、操作简便等。但是, 化学反应法的特异性相对比较差, 一些氧化还原反应或者酶催化反应往往对测定结果的判断产生影响, 一般需要其他分析方法作为比较, 才能获得满意的结论。

化学发光法

化学发光测定法是仪器分析中灵敏度最高的方法之一, 已在医学、环境以及工业分析等许多领域里得到广泛的应用 。活性氧的化学发光研究也是活性氧测定法研究领域中比较活跃的分支之一, 特别是针对H2O2 测定, 有许多灵敏度高、选择性好的化学发光体系 。进年来, 笔者在H2O2 测定方面开发了一系列高灵敏度的化学发光分析法。除此之外, 目前比较成功的活性氧化学发光测定法主要有鲁米诺法(luminol)、光泽精法(lucigenin)和cypridina luciferin analog(CLA)法。

分光光度法

活性氧的分光光度测定, 最常用的方法有细胞色素丙(cytochrome C)的超氧自由基还原法 和硝基四氮唑篮(nitro blue tetrazolium ,NBT)还原法 。具有氧化活性的细胞色素C 被·O-2 还原后, 形成了在波长550 nm 处有强吸收的亚铁细胞色素 , 可以用于O-2 的直接测定, 在SOD 存在下,O-2 受到SOD 的催化形成H2O2 和O2 , 以被开发为SOD 的间接定量分析法 。

但是, 活性氧的细胞色素丙还原法存在着其它还原性物质, 如HADPA 和还原性酶的干扰, 一般情况下无法直接用于O-2 的定性分析, 需要比较在SOD 的存在下, 是否还有O-2 与细胞色素丙发生反应的结果, 从而判断O-2 的生成与否。

荧光光度法

与化学发光一样, 荧光分光光光度法也是灵敏度高, 操作简便的分析方法之一。比较典型的例子是, 二氯荧光素(DCFH)在过氧化物酶存在下, 被H2O2 或者HO-2 氧化形成具有有萤光的DCF , 可以有效地应用于H2O2 定量分析[ 23] 。利用2 , 3-二氨基萘(DAN)与NO-2 在酸性条件下发生反应, 形成荧光性的1-(H)-萘三氮茂环, 有人提出用2 , 3-二氨基萘(DAN)作为NO 的测定方法。

电子自旋共振法

电子自旋共振法（ESR法） 作为活性氧的化学反应后的检测方法, 可以理解成是一种自由基的标识反应, 即向活性氧生成的反应体系中添加本身带有不对称电子的自由基, 这一添加物与活性氧发生反应后失去不对称电子, 从而导致ESR 信号的变化。

氧是生命运动过程中不可缺少的一种气体, 人们一旦处于缺氧或者供氧不足的环境中, 就会感到憋气的痛苦甚至死亡。所以, 自从1770 年代初英国人Joseph Priestley 发现氧以来, 氧一直被人们认为是一种对人体百益而无一害的气体。可是, 科学技术迅速发展起来的今天, 我们知道, 不管是空气中的氧还是水中的溶解氧都具有较高的氧化性, 与一般的金属铁一样, 处于空气中的人体各部位都在不断地受到氧的腐蚀而“生锈” , 当然这种腐蚀与铁不同, 它体现在人体的细胞水平上。特别是人体各种器官随着年龄的增大不断地老化更是这种腐蚀“生锈”的直观表现。1969 年McCord 与Fridovich 发现, 在生化反应过程中O2 获得一个电子还原生成超氧自由基(O-2 ), 进而经过红血球的分离精制后获得O-2 的清除灭活酶, 并命名为超氧化物歧化酶(superoxide dismultase , SOD)。这一发现激发了大批的科学研究者致力于O-2 的生成过程、反应活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究, 去探索解明SOD 在生理学上的意义。同时由O-2 衍生出来的过氧化氢(H2O2)、羟自由基(·OH)、激发态氧(一重态氧或称单线态氧,O2)也受到了人们的重视。

所谓的活性氧, 概括地说, 是指机体内或者自然环境中由氧组成, 含氧并且性质活泼的物质的总称:主要有一种激发态的氧分子, 即一重态氧分子或称单线态氧分子(O2);3 种含氧的自由基, 即超氧阴离子自由基(O-2 )、羟自由基(·OH)和氢过氧自由基(HO2);2 种过氧化物, 即过氧化氢(H2O2)和过氧化脂质(ROOH)以及一种含氮的氧化物(NO)等。这些物质化学反应活性强、存在寿命短, 如O2 的平均寿命为2μs 、·OH 自由基200 μs 、O-2 自由基5 s 。正是由于它们寿命短、反应活性高, 到目前为止除了H2O2 以外,其它活性氧的测定仍然是一项国际性难题, 还没有特别专一有效的方法。一般情况下采用的分析方法可大体有化学反应法 、捕捉法和直接测定法。

对核酸的氧化损伤

DNA 的氧化损伤主要包括：一是碱基的修饰。羟基自由基可对胸腺嘧啶的5，6-双键进行加成，形成胸腺嘧啶自由基。碱基的改变可导致其基团控制下的许多生化与蛋白合成过程受到破坏。二是键的断裂。自由基从DNA 的戊糖夺取了氢原子，使之在C4位置形成具有未配对电子的自由基，然后，此自由基又在β-位置发生链的断裂。O2也能分解核苷酸，尤其是鸟苷酸，对鸟苷、腺苷、胞苷及尿苷分解的比例为26∶13∶8∶1。受到氧化损伤后的DNA 可能会发生断裂、突变以及对热稳定性改变等，从而严重影响了遗传信息的正常转录、翻译过程。

对蛋白质的氧化损伤

活性氧对蛋白质的作用包括修饰氨基酸，使肽链断裂，形成蛋白质的交联聚合物，改变构像和免疫原性等5 个方面。

修饰氨基酸

蛋白质分子中起关键作用的氨基酸成分对自由基损害特别敏感，以芳香氨基酸和含硫氨基酸最为突出，不同的自由基对特定氨基酸侧链有特殊影响，如超氧阴离子介导甲硫氨酸氧化成为甲硫氨酸亚砜，半胱氨酸氧化成为磺基丙氨酸；羟自由基可以将脂肪族氨基酸α-位置上的一个氢原子去掉；烷氧自由基和过氧自由基等中间产物可以使色氨酸氧化为犬尿氨酸、N-甲基犬尿氨酸和五羟色氨酸。

使肽链断裂

活性氧所致蛋白质肽链断裂方式有2 种，一种是肽链水解，另一种是从α-碳原子处直接断裂，究竟以何种方式断裂取决于活性氧和蛋白质的类型、浓度和二者之间的反应速率。肽键的水解常发生在脯氨酸处，其机制为活性氧攻击脯氨酸使之引入羰基而生成α-吡咯烷酮，经水解与其相邻的氨基酸断开，α-吡咯烷酮成为新的N-末端，可以进一步水解成为谷氨酰胺。肽链直接断裂的方式是活性氧攻击α-碳原子生成α-碳过氧基，后者转化为亚氨基肽，经过弱酸水解为氨基酸和双羧基化合物。

形成蛋白质交联聚合物

多种机制可以导致蛋白质的交联和聚合。蛋白质分子中的酪氨酸可以形成二酪氨酸，半胱氨酸氧化形成二硫键，两者均可以形成蛋白质的交联。交联可以分为分子内交联和分子间交联2 种形式。蛋白质分子中酪氨酸和半胱氨酸的数目可以决定交联的形式。另外，脂质过氧化产生的丙二醛（MDA）与蛋白质氨基酸残基反应生成烯胺，也可以造成蛋白质交联。生物体内单糖自动氧化的α-羰醛产物可以与蛋白质交联而使酶失活，并使膜变形性下降，导致细胞衰老与死亡。

改变构像

蛋白质经氧化后，热动力学上不稳定，部分三级结构打开，失去原有构像。用H2O2和抗坏血酸-Fe（III）氧化SOD，其紫外吸收增强，内源性荧光减弱，表明酶分子由紧密有序排列趋于松散无序。用自旋标记研究，探测到较低浓度抗坏血酸-Fe（III）和H2O2，就可以影响到SOD 分子亚基缔合或其周围的结构。

改变免疫原性

用H2O2，或H2O2，-Cu2 和抗坏血酸-Fe（III）体系作用于牛红细胞铜锌超氧化物歧化酶（SOD）， 人血清白蛋白（HAS） 和人IgG， 结果发现SOD、HAS 和IgG 与其抗体反应增强， 提示活性氧可能参与了某些自身免疫性疾病中抗原抗体复合物的形成过程。

对生物膜的损伤

自由基对生物膜的损伤是作用于细胞膜及亚细胞器膜上的多不饱和脂肪酸，使其发生脂质过氧化反应，脂质过氧化的中间产物脂自由基（L·）、脂氧自由基（LO·）、脂过氧自由基（LOO·）可以与膜蛋白发生攫氢反应生成蛋白质自由基，使蛋白质发生聚合和交联。另外，脂质过氧化的羰基产物（如丙二醛）也可攻击膜蛋白分子的氨基，导致蛋白质分子内交联和分子间交联。另一方面自由基也可直接与膜上的酶或与受体共价结合。这些氧化损伤破坏了镶嵌于膜系统上的许多酶和受体、离子通道的空间构型，使膜的完整性被破坏、膜流动性下降，膜脆性增加，细胞内外或细胞器内外物质和信息交换障碍，影响膜的功能与抗原特异性，导致广泛性损伤和病变。机体中HO·大部分在细胞器中产生，特别是在线粒体中产生，造成线粒体膜的损伤，导致细胞和机体的能量代谢障碍。