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Sober和Peterson于1956年首次将离子交换基团结合到纤维素上,制成了离子交换纤维素,成功地应用于蛋白质的分离。从此使生物大分子的分级分离方法取得了迅速的发展。离子交换基团不但可结合到纤维上,还可结合到交联葡聚糖(S-ephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose)上。近年来离子交换色谱技术已经广泛应用于蛋白质、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体和多糖的分离和纯化。
离子交换剂分为两大类,即阳离子交换剂和阴离子交换剂。各类交换剂根据其解离性大小,还可分为强、弱两种,即 强酸剂 阳离子交换剂 弱酸剂 强硷型 阴离子交换剂 弱硷型。
1.阳离子交换剂
阳离子交换剂中的可解离基因是磺酸(-SO3H)、磷酸(-PO3H2)、羧酸(COOH)和酚羟基(-OH)等酸性基。
某些交换剂在交换时反应如下:
强酸性:R-SO3-H++Na+ R-SO3- Na+H+
弱酸性:R-COOH+Na+ R-COONa+H+
国产树脂中强酸1×7(上海树脂#732)和国外产品Dowex 50、Zerolit 225等都于强酸型离子交换剂。
2.阴离子交换剂
阴离子交换剂中的可解离基因是伯胺、(-NH2)、仲胺(-NHCH3)、叔胺[N-(CH3)2]和季胺[-N(CH3)2]等硷性基团。某些交换反应如下:强硷性:R-N+(CH3)2 H·OH-+Cl R-N+(CH3)2 Cl+OH-弱硷性:R-N+(CH3)2 H·OH-+Cl R-N+(CH3)2 HCl+OH-强硷性#201号国产树脂和国外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都属于强硷型阴离子交换剂。
1.纤维素离子交换剂:阳离子交换剂有羟甲基纤维素(CM-纤维素),阴离子交换剂有氯代三乙胺纤维纱(DESE-纤维素)。2.交联葡聚糖离子交换剂:是将交换基因连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂,因而既具有离子交换作用,又具有分子筛效应,是一类广泛应用的色谱分离物质。常用的Sephadex离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂有DEAE-Sephadex A-25,A-50和QAE- Sephadex A25,A50; 阳离子交换剂有CM-Sephaetx C-50,C-50和Sephadex C-25,C-50。阴离子交换剂用英文字头A,阳离子交换剂的英文字头是C。英文字后面的数字表示Sephadex型号。3.琼脂糖离子离交换剂:是将DESE-或CM-基团附着在Sepharose CL-6B上形成,DEAE-Sephades(阴离子)和CM-Sepharose(阳离子),具有硬度大,性质稳定,凝胶后的流速好,分离能力强等优点。
新出厂的树脂是干树脂,要用水浸透使之充分吸水膨胀。因其含有政绩一些杂质,所要要用水、酸、硷洗涤。一般手续如下:新出厂干树脂用水浸泡2小时后减抽压去气泡,倾去水,再用大量无离子水洗至澄清,去水后加4倍量2N HCl搅抖4小时,除去酸液,水洗到中性,再加4倍量2N NaOH搅抖4小时,除硷液,水洗到中性备用。将树脂带上所希望的某种离子的操作称为转型。如希望阳树脂带Na+,则用4倍量NaOH搅拌浸泡2小时以上;如希望树脂带H+,可用HCl处理。阴树脂转型也同样,若希望带Cl-则用HCl,希望带OH-则用NaOH。用过的树脂使其恢复原状的方法称为再生。并非每次再一都用酸、硷液洗涤,往往只要转型处理就行了。
⑴交换剂装柱最简单的交换层析柱可用硷式滴定管代替。处理过的树脂放入烧杯,加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中,使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。
⑵上样向层析柱内倾入样品液⑶洗脱与收集
不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子,把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质,因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。
离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物,如树脂,纤维素,葡聚糖,醇脂糖等,它的分子中含有可解离的基团,这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。虽然交换反应都是平衡反应,但在层析柱上进行时,由于连续添加新的交换溶液,平衡不断按正方向进行,直至完全。因此可以把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来,同理,当一定量的溶液通过交换柱时,由于溶液中的离子不断被交换而波度逐减少,因此也可以全部被交换并吸附在树脂上。如果有两种以上的成分被交换吸着在离子交换剂上,用洗脱液洗脱时,在被洗脱的能力则决定于各自洗反应的平衡常数。蛋白质的离子交换过程有两个阶段──吸附和解吸附。吸附在离子交换剂上的蛋白质可以通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而达到解离但更多的是通过增加离子强度,使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置,使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。不同蛋白质与离子交换剂之间形成电键数目不同,即亲和力大小有差异,因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来,达到分离纯化的目的。
它们的优点是:⑴具有开放性支持骨架,大分子可以自由进入和迅速扩散,故吸附容量大。⑵具有亲水性,对大分子的吸附不大牢固,用温和条件使可以洗脱,不致引起蛋白质变性或酶的失活。⑶多孔性,表面积大、交换容量大,回收率高,可用于分离和制备。
原理:离子交换色谱(ion exchange chromatography,IEC)以离子交换树脂作为固定相,树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时,组分...
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皮芯复合材料离子交换纤维
以聚乙烯为芯层,以易接受辐射的聚丙烯为表层,通过有氧预辐射改性接枝制备皮芯复合材料离子交换纤维。使其各方面性能得到提高。
离子交换色谱法的固定相为离子交换剂,常用的有离子交换树脂和化学键合离子交换剂。经典离子交换色谱法的固定相为离子交换树脂,其缺点是易于膨胀,传质较慢,柱效低。不耐高压。HPLC中的固定相是键合在薄壳型和多孔微粒硅胶上的离子交换剂,其机械强度高,不溶胀,耐高压,传质快,柱效高。
离子交换色谱法的流动相是具有一定pH值和离子强度的缓冲溶剂,或含有少量有机溶剂,如乙醇、四氢呋喃、乙腈等,以提高色谱选择性。
离子交换色谱法的保留行为和选择性与被分离的离子、离子交换剂以及流动相的性质等有关。离子交换剂对不同离子的交换选择性不同,一般来说,离子的价数越高,原子序数越大,水和离子半径越小,则该离子在离子交换剂上的选择性系数就越大。例如,强酸型阳离子交换树脂对阳离子的选择性系数顺序为:
Fe3 〉Al2 〉Ba2 》Pb2 〉Sr2 〉Ca2 〉Ni2 〉Cd2 》Cu2 》Co2 》Mg2 》Zn2 》Mn2 〉Ag 〉Cs〉Rb 〉K 》NH4 〉Na 〉H 〉Li 。
弱酸型阳离子交换树脂的基团(如一COOH)的离解受溶液中H 抑制,所以H 在该类树脂上的保留能力很强,甚至大于二价、三价阳离子。
强碱型阴离子交换树脂对阴离子的选择性系数顺序为:柠檬酸根〉PO43-〉SO42-〉I-〉NO3-〉SCN-〉NO2-〉Cl-〉HCO3-〉CH3COO-〉OH-〉F-。
离子的保留还受流动相的组成和pH值的影响:交换能力强、选择性系数大的离子组成的流动相具有强的洗脱能力。流动相的离子强度增大,其洗脱能力增强,使组分的保留值降低。强离子交换树脂的交换容量在很宽的范同内不随流动相的pH值变化。pH值的调节主要体现其对弱电解质离解的控制,溶质的离解受到抑制,其保留时间变短。因此,pH值的变化,对弱离子交换树脂的交换能力影响较大。
离子交换是利用一种不溶性高分子化合物,它的分子中具有解离性基团(交换基),在水溶液中能与溶液中的其他阳离子或阴离子起交换作用。此种交换反应都是可逆的,一般也都是遵循化学平衡的规律。虽然交换反应都是平衡反应,但在色谱柱上进行时,由于连续添加新的交换溶液,平衡不断按正反应方向进行,直至完全,因此可以把离子交换剂上的原有离子全部洗脱下来。当一定量的溶液通过交换柱时,由于溶液中的离子不断被交换而浓度逐渐减少,因此也可以全部被交换而吸着在交换剂上,根据这一原理可以用离子交换法直接从植物提取液中交换含游离离子基团的酸、碱及两性成分,使与糖类等无游离离子基团的中性物质分开,而被吸着的物质也可用另一洗脱液洗脱下来,这就是常用的离子交换法。
如有两种以上的成分被吸着在离子交换剂上,用另一洗脱液洗脱时,它们的被洗脱能力取决于各物质洗脱反应的平衡常数,利用物质“吸附”及“解吸附”能力的不同进行分离即为离子交换色谱。
离子交换色谱法大部分采用合成离子交换剂。一种是单体在聚合前本身就含有交换基团,另一种是首先形成聚合物,然后引进交换基团。其中用途最广的是离子交换树脂。另外也有在纤维素或多聚糖上人工引入交换基团所成的离子交换剂。大多用于植物大分子蛋白质、核酸、酵素及多糖体的分离精制。