色谱柱
色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。
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色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。
色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于70 kg/cm2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同。还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2~20µm(5~10µm)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同:①常规分析柱(常量柱)，内径2~5mm(常用4.6mm，国内有4mm和5mm)，柱长10~30cm;②窄径柱(narrow bore，又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn)，内径1~2mm，柱长10~20cm;③毛细管柱(又称微柱microcolumn)，内径0.2~0.5mm;④半制备柱，内径>5mm;⑤实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm;⑥生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。
1、首先应确认柱和仪器的接头以及管路是否匹配。为减少死体积，进样阀、柱子、检测器之间的连接管路内径尽可能使用内径较小的管线，同时控制进样器、色谱柱和检测器之间连接管线的长度。安装色谱柱之前，确认流路系统中的溶剂是否正常。对分析较复杂的样品建议安装保护柱。
2、为了使色谱柱与仪器系统达最佳的连接效果，应尽量使用与色谱柱接口相匹配的螺帽和锥形接头，如原来的接头长期匹配其他类型的色谱柱，建议在连接新色谱柱前应检查匹配情况，避免造成色谱柱的损坏或因色谱柱不匹配造成的漏液。
3、使用PEEK 材料的通用接头，只需用手拧紧不需要特定扳手，使用压力为5000psi;使用温度不得超过100℃。
1、在进行样品检测前，至少使用20倍柱体积流动相使色谱柱充分平衡。流动相一定要使用色谱级别的溶剂。如使用水相的缓冲液应当天配制以保持新鲜避免细菌产生。
2、流动相使用前需用微孔滤膜过滤,消除流动相中颗粒对色谱系统和色谱柱的损坏。缓冲液与其他流动相混合后应重新过滤避免溶解度变化造成产生新的沉淀。不应使用纯水作为流动相冲洗C18色谱柱，以免柱性能损坏(添加5%的有机溶剂冲洗色谱柱，同时可以达到对缓冲盐清洗的作用。还可以使色谱柱更容易平衡)。
3、流动相需脱气后使用，可避免因气泡导致的泵和检测器的工作不正常。如果测试时使用的流动相与色谱柱保存使用的流动相有较大区别，应该使用过度分布的形式进行平衡。避免由于流动相的突然变化造成柱压增加过大或流动相缓冲盐结晶造成对色谱柱和仪器系统的损坏。正相色谱柱比反相色谱柱需要更长的平衡时间。
1、样品应当尽可能溶解在能与流动相相互溶的溶剂中。除特殊指明外，如使用强溶剂溶解样品柱子的分辨率将可能降低。
2、样品溶液在进样前应使用针头式过滤器对样品预先过滤。频繁改变流动相组成，会加速降低柱效。
3、色谱柱由高压匀浆法装填，能承受较高压力。为获得最佳分离效果，使用时请不要超过200kgf，而且避免压力突然上升或变化，否则会造成硅胶填料的破坏，减少色谱柱的使用寿命。除特殊要求外最高操作温度不要超过60℃。
1、如果流动相含有酸或无机盐，应当先用去离子水(20倍柱体积)冲洗干净。然后用用100%乙腈或甲醇保存色谱柱。最后用柱子的接头密封，并放在稳定的环境中存放。
2、应避免色谱柱受到直接的机械冲击或摔落，避免造成色谱柱性能的降低。
色谱柱的再生:
用相当于20倍柱体积的溶剂按下列顺序冲洗柱子，建议按柱子的箭头方向冲洗，尽可能不反冲。冲洗时使用的的参考溶剂顺序是水、甲醇、氯仿、异丙醇。
常见的分配柱填料:碳十八柱(ODS/C18)、碳八柱(MOS/C8)、碳六柱(Hexyl/C6)、
碳四柱(Butyl/C4)、碳一柱(Methyl/C1)、阴离子交换柱(SAX)、
阳离子交换柱(SCX)、苯基柱(Phenyl)、氨基柱(Amino/NH2)、
氰基柱(Cyano/CN/Nitrile)
常见的吸附柱填料:硅胶柱
毛细管色谱柱一般是用石英拉制而成，其外表面涂泽一层聚酰亚胺起保护作用，内部根据需要涂一层固定液
1、中低压色谱的压力区分 中压5~20bar，一般由泵提供压力；低压0~5 bar，可由压缩气体或泵提供压力；中压色谱可以使用更细的填料或更长的柱子，分辨率高于低压色谱； 2、中低压色谱柱 ...
chromatographic column
装填有固定相用以分离混合组分的柱管。
多为金属或玻璃制作。有直管形、盘管形、U形管等形状。
色谱柱可分为填充柱和开管柱两大类。液相色谱通常均采用填充柱。
色谱柱的分离效果取决于所选择的固定相，以及色谱柱的制备和操作条件。
色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等，其粒度一般为3,5,7,10μm等，柱效理论值可达5~16万/米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效;对于同系物分析，只要500即可;对于较难分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。
柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。
因强调分析速度而发展出短柱，柱长3~10cm，填料粒径2~3µm。为提高分析灵敏度，与质谱(MS)联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱(microbore)。细管径柱的优点是:①节省流动相;②灵敏度增加;③样品量少;④能使用长柱达到高分离度;⑤容易控制柱温;⑥易于实现LC-MS联用。
但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器(甚至采用柱上检测)，更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能:输液泵能精密输出1~100µl/min的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小，要求高灵敏度的检测器，电化学检测器和质谱仪在这方面具有突出优点。
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓(如前所述)。
② 应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。
③ 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
④ 选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
⑤ 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。
⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50~75ml。
下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考:硅胶柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇(乙腈)冲洗时重复注射100~200µl四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脱能除去蛋白质污染。
阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有机物)、甲醇、水依次冲洗。
⑦ 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
⑧ 色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗;另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染;如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。
在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1~2mm高度(注意把被污染填料取净)再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱(5~30mm)，可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。
通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2~9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。
每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。
色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度>20um时，干法填充制备柱较为合适;颗粒<20um时，湿法填充较为理想。填充方法一般有4种:①高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充;②径向加压法，Waters专利;③轴向加压法，主要用于装填大直径柱;④干法。柱填充的技术性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱。
必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的的结构是否合理。
无论是自己装填的还是购买的色谱柱，使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下(样品、流动相、流速、温度)下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时，还要注意柱外效应是否有变化。
一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。
一、石墨化碳填料
硅胶的化学稳定性较差，仅能在pH=2~8的环境下工作。但是，在很多场合下，需要使用极端的pH条件。为此，人们曾大力发展高分子微球、氧化铝、氧化锆等化学稳定性更好的基质材料。但是，很难有一种材料能全面地满足液相色谱基质的要求。例如，高分子微球在有机溶剂中会发生一些溶胀，因此难以应用于以含有机溶剂的流动相进行梯度淋洗的场合;氧化铝和氧化锆与硅胶相比，虽然化学稳定性较好，但其表面修饰与键合比较困难。因此，化学稳定性好的碳材料便很自然地被考虑作为色谱填料的基质。
碳材料有极好的化学稳定性，可耐受宽达pH=1~14的环境;耐高温，石墨化碳可耐3000℃以上的高温而不受破坏;经适当加工的碳材料可具有很好的机械强度，具有优良的导电性、导热性及电磁屏蔽特性。更为难能可贵的是，多孔性碳材料以其结构的特点而具有很好的吸附性及选择性。正是碳材料的这些特性，使人们期待它在色谱领域中能有特殊的用途。
二、贯流色谱填料
贯流色谱是20世纪80年代末至90年代初发展起来的一种色谱分离新方法。在这种填料上，既有通常的微孔或大孔，例如50~150nm的微孔，又有贯穿整个颗粒的，孔径约600~800nm超大孔存在。这种贯穿的大孔，可以允许流动相直接进入填料颗粒的内部并贯穿而过。这样，就相当于极大地降低了填料颗粒的直径，即以贯穿孔将填料分割成了很多更细小的颗粒，在这种小颗粒上的微孔已经短到不对传质过程构成明显的阻力。因此，在这种贯流色谱填料上，传质阻力已经非常小。同时，贯穿孔内流动相的线速度正比于柱子中流动相的速度，即传质过程已由扩散传质变为对流传质。这就意味着，在一定范围内，及时提高流动相速度，也不会降低柱子的分离效率。由于填料上同时还存在有通常的多孔结构，其比表面积并未随贯穿孔的出现而大幅度降低。
因此，在这种填料上的样品负载量也不随流速的增加而减少。再者，填料上600~800nm的贯穿孔，极大地增加了柱子的通透性，使得这种柱子即使工作于很高的流速下，其操作压力也不需要很高。所以，这种贯流色谱柱可以同时具有高流速、高效率、高样品负载量和低操作压力的特点。
三、整体柱
整体柱又称整体固定相、棒柱、连续床等，是在柱管内原位聚合或固定化了的连续整体多孔结构，可根据需要对整体材料的表面作相应的衍生化，是一种新型的用于分离分析或作为反应器的多孔介质。通过控制聚合条件来得到具有理想孔径分布的整体柱。整体柱中的空间由聚合物颗粒中的孔和颗粒间的缝隙组成，分离在样品流经孔结构时发生。可以减少路径的差异和纵向扩展。
整体柱的优点包括:可以原位制备，省去制备填料和装柱，也可以同法制成聚合物颗粒后再装柱;聚合物易于制备，柱子的长度和直径在一定程度上不受限制;聚合反应混合物中的单体可以灵活选择以得到适合的基质和性质;易于在柱衍生化，以得到具有合适性质的色谱柱;通过控制聚合反应的条件可以优化孔的性状。
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色谱柱应用问题排查与使用维护_3[1]
色谱柱应用问题排查与使用维护_3[1]
?2012 Waters Corporation 色谱柱应用问题排查与使用维护 化学消耗品部 李桂芳 Guifang_li@waters.com 2 012.4.11 哈尔滨 ?2012 Waters Corporation 合理 的逻 辑判 断 － 题 将会 节省 解决 问 的时 间 色谱问题的可能根源 样品溶液 流动相 泵 进样器 在线过滤器 连接管路及接头 保护柱 色谱柱 检测器 工作站 操作人自己！！ ?2012 Waters Corporation 3 新柱和 /或项目开始之前 色谱柱刚使用时出现的问题排查 色谱柱使用过程中的问题排查 内容提纲 ?2012 Waters Corporation 4 新柱和 /或项目开始之前 ——好的操作习惯可以预防问题发 生！ — 了解你的色谱柱 — 测试色谱柱的柱效 新柱使用时出现的问题排查 色谱柱使用过程中的问题排查 内容提纲
色谱柱是进行色谱分析的主要仪器，色谱柱的正确安装才能保证发挥其最佳的性能和延长使用寿命。 正确的安装请参考以下步骤：
步骤1. 检查气体过滤器、载气、进样垫和衬管等检查气体过滤器和进样垫，保证辅助气和检测器的用气畅通有效。如果以前做过较脏样品或活性较高的化合物，需要将进样口的衬管清洗或更换。
步骤2. 将螺母和密封垫装在色谱柱上，并将色谱柱两端要小心切平
步骤3. 将色谱柱连接于进样口上色谱柱在进样口中插入深度根据所使用的GC仪器不同而定。正确合适的插入能最大可能地保证试验结果的重现性。通常来说，色谱柱的入口应保持在进样口的中下部，当进样针穿过隔垫完全插入进样口后如果针尖与色谱柱入口相差1-2cm，这就是较为理想的状态。（具体的插入程度和方法参见所使用GC的随机手册）避免用力弯曲挤压毛细管柱，并小心不要让标记牌等有锋利边缘的物品与毛细柱接触摩擦，以防柱身断裂受损。将色谱柱正确插入进样口后，用手把连接螺母拧上，拧紧后（用手拧不动了）用扳手再多拧1/4-1/2圈，保证安装的密封程度。因为不紧密的安装，不仅会引起装置的泄漏，而且有可能对色谱柱造成永久损坏。
步骤4. 接通载气当色谱柱与进样口接好后，通载气, 调节柱前压以得到合适的载气流速（见下表）。
| Psi |
15m |
25m |
30m |
50m |
100m |
| 0.20mm |
10-15 |
20-30 |
18-30 |
40-60 |
80-120 |
| 0.25mm |
8-12 |
13-22 |
15-25 |
28-45 |
55-90 |
| 0.32mm |
5-10 8- |
15 |
10-20 |
16-30 |
32-60 |
| 0.53mm |
1-2 |
2-3 |
2-4 |
4-8 |
6-14 |
以上仅为建议的起始设置，具体数值要依据实际的载气流速。将色谱柱的出口端插入装有己烷的样品瓶中，正常情况下，我们可以看见瓶中稳定持续的气泡。如果没有气泡，就要重新检查一下载气装置和流量控制器等是否正确设置，并检查一下整个气路有无泄漏。等所有问题解决后，将色谱柱出口从瓶中取出，保证柱端口无溶剂残留，再进行下一步的安装。
步骤5. 将色谱柱连接于检测器上其安装和所需注意的事项与色谱柱与进样口连接大致相同。如果在应用中系统所使用的是ECD或NPD等，那么在老化色谱柱时，应该将柱子与检测器断开，这样检测器可能会更快达到稳定。
步骤6. 确定载气流量，再对色谱柱的安装进行检查注意：如果不通入载气就对色谱柱进行加热，会快速且永久性的损坏色谱柱。
步骤7. 色谱柱的老化色谱柱安装和系统检漏工作完成后，就可以对色谱柱进行老化了。
对色谱柱升至一恒定温度，通常为其温度上限。特殊情况下，可加热至高于最高使用温度10-20℃左右，但是一定不能超过色谱柱的温度上限，那样极易损坏色谱柱。当到达老化温度后，记录并观察基线。初始阶段基线应持续上升，在到达老化温度后5-10分钟开始下降，并且会持续30-90分钟。当到达一个固定的值后就会稳定下来。如果在2-3小时后基线仍无法稳定或在15-20分钟后仍无明显的下降趋势，那么有可能系统装置有泄漏或者污染。遇到这样的情况，应立即将柱温降到 40℃以下，尽快的检查系统并解决相关的问题。如果还是继续的老化，不仅对色谱柱有损坏而且始终得不到正常稳定的基线。
一般来说，涂有极性固定相和较厚涂层的色谱柱老化时间长，而弱极性固定相和较薄涂层的色谱柱所需时间较短。而PLOT色谱柱的老化方法有各不相同。 PLOT柱的老化步骤:HLZ Pora 系列 250℃， 8小时以上Molesieve分子筛 300℃ 12小时Alumina氧化铝 200℃ 8小时以上由于水在氧化铝和分子筛PLOT柱中的不可逆吸附，使得这两种色谱柱容易发生保留行为漂移。
当柱子分离过含有高水分样品后，需要将色谱柱重新老化，以除去固定相中吸附的水分。
步骤8. 设置确认载气流速对于 毛细管色谱柱，载气的种类首选高纯度氮气或氢气。载气的纯度最好大于99.995%，而其中的含氧量越少越好。如果您使用的是 毛细管色谱柱，那么依照载气的平均线速度（cm/sec）,而不是利用载气流量（ml/min）来对载气做出评价。因为柱效的计算采用的是载气的平均线速度。推荐平均线速度值：氮气：10-12cm/sec 氢气：20-25cm/sec载气杂质过滤器在载气的管线中加入气体过滤装置不仅可以延长色谱柱寿命，而且很大程度的降低了背景噪音。建议最好安装一个高容量脱氧管和一个载气净化器。使用ECD系统时，最好能在其辅助气路中也安装一个脱氧管。
步骤9. 柱流失检测在色谱柱老化过程结束后，利用程序升温作一次空白试验（不进样）。一般是以10℃/min从50℃升至最高使用温度，达到最高使用温度后保持 10min。这样我们就会的到一张流失图。这些数值可能对今后作对比试验和实验问题的解决有帮助。空白试验的色谱图，不应该有色谱峰出现。如果出现了色谱峰，通常可能是从进样口带来的污染物。如果在正常的使用状态下，色谱柱的性能开始下降，基线的信号值会增高。另外，如果在很低的温度下，基线信号值明显的大于初始值，那么有可能是色谱柱和 GC系统有污染。其他：色谱柱的保存用进样垫将色谱柱的两端封住，并放回原包装。在安装时要将色谱柱的两端截去一部分，保证没有进样垫的碎屑残留于柱中。
注意：当空气中氢气的含量在4-10%时，就有爆炸的危险。所以一定要保证实验室有良好的通风系统。 2100433B
Nanofilm 系列高分辨率纳米凝胶色谱柱
Nanofilm 系列高分辨率纳米凝胶色谱柱
成都摩尔科学仪器有限公司专业提供适合各种样品的凝胶色谱柱。下面为大家介绍一款Nanofilm凝胶色谱柱，如有需要欢迎拨打028-85115092.或者搜索成都摩尔科学仪器有限公司。
Nanofilm凝胶色谱柱产品描述：
Nanofilm体积排阻（SEC）固定相是以高纯度具有良好机械稳定性的硅胶为基质，表面化学键合有一层均一、亲水、纳米厚度的中性聚合物薄膜。该固定相的一个特点是可使用低盐浓度，或含有机溶剂的缓冲液作为流动相进行生物样品的分离，并具有高的分辨率和样品回收率。该色谱填料为窄粒径分布的球形硅胶颗粒。孔径规格有150、250、450和950Å。
不同规格Nanfilm SEC固定相的特征参数
Nanofilm 系列高分辨率纳米凝胶色谱柱产品特点：
● 高的分辨率和分离效率
● 在高浓度盐溶液中非常稳定
● 高的重复性
● 可在低浓度盐溶液中进行蛋白的分离
● 高的蛋白回收率，并可保持其生物活性
● pH适用范围2-9
高效分离
对于生物分离而言，生物分子与填料之间的非特异性相互作用往往会导致低的分离效率，如色谱峰拖尾以及低的回收率等。Nanofilm SEC填料所采用的独特的表面化学技术可以在硅胶表面共价键合一层均匀的聚合物链。这种固定相具有中性和亲水的性质，因此可以大限度消除填料基质与生物分子，其中尤其是与蛋白之间的非特异性相互作用。这种经过特别设计的涂层可以使Nanofilm SEC柱获得高的分辨率和分离效率。例如，以尿嘧啶作为测试物可以获得高达每米90,000的理论塔板数（见表1）。
表1 Nanofilm SEC柱的柱效，以尿嘧啶为待测物（0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.0）
标准蛋白分离
Nanofilm SEC柱高效分离的例子见图1。四种蛋白质，甲状腺球蛋白、BSA二聚体、BSA和溶菌酶，以及一种多肽在Nanofilm SEC柱上得到了满意的分离。以溶菌酶计得到的理论塔板数高至30,000/m，因此溶菌酶中的一种杂质都可以得到很好的分离，而这种分离效果通常只有在高效毛细管电泳中才看得到。SEC柱的标准测试样品通常为Biorad 标准蛋白（甲状腺球蛋白、免疫球蛋白G 、卵清蛋白、肌球素）。这些蛋白质的pI均小于7.5，因此在pH=7.0时不会带有明显的正电荷。但是高度带正电荷的蛋白质，如溶菌酶（pI 11.0）、细胞色素（pI 10.6）、抑肽酶（pI 11.0）却容易与填料表面的残余硅羟基发生强静电相互作用而非常难被洗脱。Nanofilm SEC柱不存在这个问题。而且，成都摩尔公司建立了自己的蛋白测试标准样品，其中就包括了对生物分离性能非常敏感的溶菌酶。
图1 在4.6mm I.D.×250mm Nanofilm SEC-150色谱柱上分离4种蛋白和一个多肽。
BSA与BSA二聚体的分离
从图2可以看到，Nanofilm SEC-250色谱柱（4.6mm I.D.×300mm），可以获得牛血清白蛋白（BSA）和BSA双聚体的分离，其中流动相为150mM的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。
甲状腺球蛋白中聚合体的分离
甲状腺球蛋白是一个大分子量蛋白（MW 670,000）。商品化的甲状腺球蛋白含有聚合体杂质，可能是双聚体或四聚体。从图3可以看到，Nanofilm SEC-500可以对甲状腺球蛋白和甲状腺球蛋白聚合体实现基线分离。
图3 用Nanofilm SEC-500色谱柱（5µm, 4.6mm I.D.×300mm）从甲状腺球蛋白中分离出聚合体。
孔结构对分离的影响
SEC填料孔径的大小在蛋白分离中起到至关重要的作用。对于在某一特定分子量范围内分布的蛋白样品而言，Nanofilm SEC固定相规格的选择需要基于填料的排除极限和线性分子量范围这两个参数。
高的蛋白回收率及蛋白活性的保持
Nanofilm SEC填料是在硅胶表面大限度地共价键合一层亲水的中性薄膜。蛋白或其它生物分子与这种填料的相互作用非常小。因此，蛋白在硅胶表面的吸附将会被抑制，这就保证了高的回收率，并可使蛋白在分离之后依然有着高的生物活性。表2是实验测得的酸性蛋白BSA和碱性蛋白溶菌酶的回收率数据。
表2 蛋白在Nanofilm SEC色谱柱上的回收率（色谱柱规格4.6mm I.D.×250mm，流动相为0.15M磷酸盐缓冲液，pH 7.0）
Nanofilm SEC固定相的高稳定性
Nanofilm SEC固定相具有致密的涂层键合密度，因此可阻止任意分子破坏硅胶与固定相之间的键合，从而保证填料具有高的稳定性。Nanofilm SEC固定相可用于多种缓冲液中，如醋酸铵、磷酸盐、Tris等。当用150和100mM的磷酸缓冲液（pH7.0）作为流动相时，在3个月或进样1000次后Nanofilm SEC柱的性能仅会发生轻微的改变，保留时间的偏差在5%以内。图5是Nanofilm SEC-150在1、5和10天，每天运行10小时得到的结果。从图中可以看到流出曲线基本重合。图6是两周内蛋白和一个小分子在500倍柱体积内保留时间的变化情况。从图中可以看到保留时间变化的差异非常小。 Nanofilm SEC固定相可在高盐浓度，如1.0M下使用。另外，Nanofilm SEC柱在有机溶剂如甲醇、乙醇、THF、DMF、DMSO等中，以及其与水的混和溶液中也相当稳定。 Nanofilm SEC柱在pH 2-8.5范围内稳定。另外，在短时间内也可以耐受高的pH，如pH 8.5-10。 Nanofilm SEC柱在温度耐受方面表现突出。高工作温度可达到80°C。
蛋白分子量的校正
对于SEC而言，填料孔径的大小决定了所能分离的分子量范围，而孔体积则决定了分离容量。Nanofilm填料拥有4种孔径规格，可以覆盖一个宽范围分子量分布的生物大分子。图7是Nanofilm SEC-150、Nanofilm SEC-250和Nanofilm SEC-500的蛋白分子量校正曲线。
图7 Nanofilm SEC柱的蛋白分子量校正曲线图。色谱条件：色谱柱4.6mm I.D.´300mm, 填料粒径为5µm；流动相为150mM磷酸盐缓冲液, pH 7.0；流速为0.25mL/min；检测波长为214nm；进样体积为5µL。样品为: 1. 甲状腺球状蛋白(670kD), 2. IgG(150kD), 3. BSA双聚体(132kD), 4. BSA (66kD), 5. 卵清蛋白(44kD), 6. 肌红蛋白(17.6kD), 7. 溶菌酶(14.3kD), 8. B12 (1.35kD), 9. 尿嘧啶(120D)。
另一种广泛使用的表征SEC固定相的方法是以蛋白的分子量对扩散系数（Kd）作图。Kd按下式定义： Kd= (Ve-Vo)/(VT-Vo) 其中Ve、VT和Vo分别是样品洗脱体积，色谱柱的总体积和柱的死体积。蛋白分子量和Kd的线性区间经常会被作为SEC固定相选择的参考。如图8所示，Nanofilm SEC-150在一个宽的分子量范围内分子量和Kd之间有着良好的线性关系。
图8 Nanofilm SEC-150的蛋白分子量校正曲线。色谱柱：Nanofilm SEC-150 (4.6mm I.D.×150mm, 5µm)；流动相：100mM磷酸缓冲液，pH 7.0；流速：0.25mL/min；检测波长：UV 214nm；温度：室温（23°C）；进样体积，5µL。样品：（1） 甲状腺球蛋白（670KD）；（2） IgG（150KD）；（3）BSA双聚体（132KD）；（4 ）BSA（66KD）；（5）卵清蛋白（44KD）；（6）a-胰凝乳蛋白酶（25KD）；（7）肌红蛋白（17.6kD）；（8）溶菌酶（14.3kD）；（9）多肽样品（1.5kD）；（10）尿嘧啶（120D）。
低盐浓度下蛋白的分离
对于带正电荷蛋白的分离，往往需要用高盐浓度来减弱硅胶基质与蛋白之间的强静电相互作用。比如细胞色素C是一种富含正电荷的蛋白质（pI=9.6），因此很难在低盐浓度（比如50mM磷酸盐缓冲液， pH 7.0）下被洗脱出来。使用高盐浓度洗脱会限制SEC柱在蛋白分离中的应用。赛分公司所开发的Nanofilm SEC柱可以有效地分离带正电荷的蛋白质。如图9所示，采用Nanofilm SEC-500柱，细胞色素C可以在50mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中得到很好的分离，而这种分离效果是其它硅胶基质SEC柱所无法实现的。Nanofilm SEC柱的出现为SEC开拓了许多新的应用领域，例如分离对盐敏感的生物分子，蛋白相互作用的研究，以及LC/MS检测等。
SRT SEC和Nanofilm SEC的比较
与Nanofilm SEC相比，SRT SEC具有更高的分离容量和分辨率，可供选择的孔径规格也要比前者多。但是，Nanofilm SEC在一些应用，如使用低盐浓度或含可挥发性盐的有机溶剂作为流动相进行富含正电荷生物分子的分离，多维色谱分离，以及LC/MS等中表现得更为稳定，而这是传统SEC固定相所无法实现的。另外，SRT和Nanofilm SEC固定相也具有不同的选择性。SRT和Nanofilm SEC固定相可以组合起来使用，从而可为生物分子，水溶性聚合物，病毒和细菌，以及纳米颗粒等的分离提供一个完整的分离方案。
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Nanofilm SEC-150分析色谱柱
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色谱色谱柱