2011年8月于昆明

第一章制备色谱基础1

第一节非线性色谱的特点2

一、线性色谱2

二、非线性色谱3

第二节制备分离的目标和策略4

一、分离目标5

二、分离策略6

(一)分离因子α8

(二)柱效N8

(三)容量因子k10

(四)条件优化11

参考文献11

第二章制备薄层色谱12

第一节实验材料与装置12

一、薄层板12

二、展开槽14

第二节实验方法15

一、上样15

二、展开16

三、检测18

四、收集19

第三节离心薄层色谱20

参考文献21

第三章常压柱色谱22

第一节吸附柱色谱22

一、硅胶吸附柱色谱22

(一)操作步骤22

(二)硅胶吸附柱色谱的原理及其技术27

二、氧化铝吸附柱色谱36

三、活性炭吸附柱色谱38

四、聚酰胺吸附柱色谱39

五、大孔吸附树脂色谱42

(一)大孔吸附树脂42

(二)种类42

(三)操作44

(四)应用46

第二节分配柱色谱47

第三节萃取柱色谱48

第四节离子交换柱色谱52

一、离子交换色谱树脂52

(一)阳离子交换树脂53

(二)阴离子交换树脂54

二、离子交换树脂的选用55

(一)种类的选定55

(二)树脂离子型式的选择55

(三)树脂颗粒、交联度及稳定性选择56

三、离子交换柱的操作56

(一)离子交换树脂的处理56

(二)柱的操作58

四、离子交换色谱的应用59

第五节凝胶柱色谱62

一、原理62

二、凝胶过滤63

(一)填料64

(二)操作67

(三)应用70

三、凝胶渗透71

第六节亲和柱色谱72

第七节干柱色谱74

第八节并联多柱色谱77

参考文献79

第四章低压及中压制备色谱80

第一节低压制备色谱80

一、减压柱色谱81

(一) 短柱81

(二)常规柱82

二、加压柱色谱83

(一) 空气泵加压85

(二)双链球加压85

(三)氮气钢瓶加压86

(四)蠕动泵加压87

(五)快速液相色谱88

第二节中压制备色谱89

一、恒流泵91

二、色谱柱92

三、检测器94

四、自动馏分收集器和进样阀95

五、记录及数据处理95

六、分离96

第三节色 谱 饼98

第四节径向柱色谱99

第五节台锥形柱色谱100

参考文献102

第五章高压制备液相色谱103

第一节制备液相色谱仪103

一、高压输液泵104

二、进样器105

三、色谱柱105

(一)制备柱的尺寸106

(二)制备柱的类型107

四、检测器110

第二节分离设计111

一、峰接触法111

二、峰重叠法113

(一)微量组分的分离113

(二)难分离物质对的分离114

第三节实验条件选择115

一、固定相116

二、流动相117

三、样品的溶解119

四、制备性分离120

第四节大直径柱122

第五节二维制备液相色谱125

参考文献129

第六章高速逆流色谱130

第一节逆流色谱130

一、液滴逆流色谱130

二、旋转小室逆流色谱131

三、离心逆流色谱132

(一)非行星式逆流色谱仪133

(二)行星式逆流色谱仪133

第二节高速逆流色谱原理及操作136

一、色谱仪136

(一)恒流泵137

(二)进样阀137

(三)主机137

(四)检测器138

(五)色谱工作站138

(六)馏分收集器138

二、分离原理138

三、实验操作143

(一)两相溶剂系统的选择143

(二)样品溶液的制备150

(三)分离151

(四)检测153

四、 pH区带提取逆流色谱154

(一)原理154

(二)操作156

五、手性分离158

六、粒子分离162

(一)碳纳米管162

(二)金属纳米粒子165

(三)微米离子166

参考文献167

第七章模拟移动床色谱169

第一节模拟移动床色谱系统和基本原理169

一、移动床色谱169

二、模拟移动床色谱系统171

(一)大型模拟移动床色谱系统171

(二)模拟移动床色谱171

三、模拟移动床色谱原理175

第二节模拟移动床工作参数的选择和优化177

一、手性固定相的选择177

(一)多糖类手性固定相178

(二)Pirkle型手性固定相180

(三)环糊精类手性固定相183

二、流动相的选择184

三、分离柱184

四、控制系统185

五、操作参数的优化185

六、模拟移动床的应用188

参考文献190

第八章其他制备色谱方法191

第一节顶替色谱191

一、填料类型192

二、顶替剂的选择192

三、操作参数193

第二节制备气相色谱194

一、原理194

二、气固色谱196

三、气液色谱196

(一)载体196

(二)固定液197

四、操作199

第三节电泳技术200

一、纸电泳201

二、琼脂平板电泳201

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳203

四、凝胶聚焦电泳204

参考文献205

第九章生物代谢产物的提取206

第一节生物大分子的提取206

一、材料选择及预处理207

二、细胞的破碎207

三、细胞器的分离208

四、蛋白质和酶的提取208

(一)水溶液提取208

(二)有机溶剂提取208

五、核酸的提取209

(一)DNA的提取209

(二)RNA的提取209

六、包涵体产品的分离210

第二节生物工程药物的提取210

第三节天然产物的分离提取211

一、浸渍法211

(一)冷浸法211

(二)温浸法211

二、煎煮法211

三、渗漉法211

四、回流法212

五、水蒸气蒸馏法212

第四节中草药系统提取分离方法213

第五节膜分离214

一、微滤和超滤216

二、反渗透217

三、电渗析218

四、透析218

参考文献219

色谱已有100余年的历史，它一开始就是为制备性分离而产生的，其目的在于分离制备一种或多种纯组分。虽然制备型色谱的研究目前处于一个相对平稳的阶段，但其应用却仍方兴未艾，常压柱色谱、低压柱色谱、中压制备色谱、高压制备液相色谱等仍是现代科学研究及生产实践中不可取代的制备性分离手段。一些专门进行有机合成的工作者往往一年可利用上百根色谱柱进行合成产物的制备性分离，甚至一天之内可进行三次以上的柱色谱操作;一些植物化学工作者70%以上的实验时间是用在使用制备色谱进行分离之上;在一些多肽、多糖、蛋白质、手性药物以及天然产物等的生产上，现代制备色谱是其必不可少的分离单元。

制备色谱技术在大多数情况下是在非线性条件下进行工作，它的理论深奥、公式复杂、进样量大、固定相和溶剂量多、成本较高，分离过程中常常因为操作者技术水平方面的原因达不到预期的制备性分离目的。其与线性条件下的色谱分析相比往往具有很大的不同，并且有些制备色谱技术本身只具备制备的特点。制备色谱技术包括了从实验室分离几毫克至几克样品的小型制备色谱直至工业用大规模制备纯物质的生产制备色谱。

本书的撰写紧紧围绕制备色谱的基础理论，避免制备色谱理论中繁杂的数学推导，充分注重方法的可操作性和实用性，比较系统、全面、详细地介绍多种制备色谱技术。第二版对各章进行了不同程度的调整或者补充，完善了不足的部分，加强了色谱操作技术;扩展了凝胶色谱，充实了高速逆流色谱的pH区带提取、手性分离、粒子分离章节;新增了大孔吸附柱色谱、台锥形柱色谱、二维高压制备液相色谱、膜分离等较多内容。但读者要系统地了解色谱基础理论和知识，至少仍需阅读本丛书中的《色谱分析概论》(第二版)分册。

本书是在本人近30年的科研和教学实践基础上写成的，部分内容受到国家自然科学基金(No.29665001、No.30160092、No.20775066、No.21075109)、教育部第三届"高校青年教师奖"(No.2001298)、云南省重点项目(No.2005E0006Z、No.99YBL-04)等10余个课题的资助。书中的较多素材直接取材于本人的研究或者与本人研究密切相关的资料文献，并与本人所编著的《手性识别材料》(科学出版社，2010)具有很好的相关性。

衷心感谢我的硕士生导师--云南大学宋文俊教授、博士生导师--北京理工大学傅若农教授、博士后导师--日本名古屋大学Y. Okamoto教授，是他们将我带入"手性识别材料及技术"领域，进行探索性的研究工作。感谢北京市新技术应用研究所张天佑教授在高速逆流色谱领域曾给予的细心指导，感谢丛书编委会以及责任编辑的辛勤工作。

本书的撰写得益于谌学先、艾萍、字敏、段爱红、李正宇等同事多年的合作以及课题组数十位博士及硕士研究生的研究，在此一并表示衷心的感谢。

由于水平的有限，书中错误和不足在所难免，敬请专家和读者给予批评指正。

袁黎明

很多初接触色谱领域的朋友对制备色谱这个名词比较陌生。其实，在化学化工医药等广泛采用的层析法以及薄层色谱就是最为典型的制备色谱，换句话说，将分析色谱的进样量增大，同时得出大量的所需物质(馏分)的过程就可以称为制备色谱。分析色谱的目的，是分析出混合物中一个(或者几个)纯物质的含量。制备色谱的目的，是从混合物中得到纯物质。而制备色谱系统则是利用制备色谱的思想高效能得到纯化物质的多个分析测试设备联用的总称。右图便是一套典型的制备色谱系统。

制备色谱是用色谱的原理，从混合物中分离出相对纯净的单组份物质，目前使用最多的是有机合成的后续分离，单组份原料药的纯化，天然产物的分离，蛋白质纯化等等。

制备色谱的分类：（一般按照压力来分类，但是没有固定的数值来限制）

常压制备色谱（重力驱动）是目前应用最广泛，最简单的制备色谱。

优点：容易操作，方便，不要额外购买仪器，只要购买玻璃柱和展开剂即可。在天然产物分离有传统优势和使用范围；与TLC直接相关，容易摸索条件。

缺点：分离时间长，溶剂不好循环使用，与环境直接连接，试剂容易挥发，污染环境；使用玻璃柱，容易损坏伤人。

Flash制备色谱，一般压力在0.5-1MPa，使用时压力在0-0.5MPa。

中压制备色谱，一般压力在1-5MPa，使用时压力在0.5-2MPa。

由于以上的压力均比高压要小很多，所以更多的说法是把快速制备色谱和中压制备色谱合称为中低压制备色谱。

优点：相对于常压色谱来说，分离效率来的更高；在蛋白质纯化上有天然传统优势；比高压制备色谱来的经济，仪器要求配置低，而且用户可以自己装柱；使用预装柱，可以提高效率；与TLC有一定的直接关系，利用TLC可以快速的建立分离方法。

缺点：对难分离的物质，无法实现高纯度的分离效果，由于使用仪器，需要一定的仪器购买费用；大量生产，需要轴向压缩，模拟移动床色谱等系统。

高压制备色谱，压力一般在10-30Mpa以下，正常使用压力在5-15MPa。

优点：可以一次性实现小批量物质的高纯纯化，色谱柱分离效率高。

缺点：成本比中低压制备高很多，至少在40%以上；色谱柱需要向制备色谱柱生产公司购买，费用很高；由于是高压运转，仪器损坏几率大，维修成本高；分离方法开发必须在HPLC上先进行。

正如右图所示，传统的制备色谱一般由一台可以连续输送液体的恒流泵、紫外检测仪与色谱柱构成，其中最重要的部件是价格不一，款式多样的色谱柱，这也是影响最终制备效果的关键性环节。柱子有多种类型，不仅材质不一，填料也有很多学问，下面简要的说说关于柱子的一些情况:

各种规格的玻璃柱子在实验室里头很容易得到，而且价格低廉，但玻璃柱子致命的弱点是它能承受的压力很小，且非常容易破碎。当由于压力太小而导致流动相流速很慢的时候，高位液面或加高压空气(或者氮气)的采用是一个简单的解决办法。在底下加真空，也能在一定程度上解决这个问题。

不锈钢柱子具有良好的耐腐蚀、抗压力性能，但其价格相对很贵。如果，只有很小的分离任务且经费也允许，市面上直径为1cm的小型制备柱就是首选。

有机玻璃柱子也能抗压力耐腐蚀，相对不锈钢柱子而言，它是半透明的，可以看到液体的运行状态，对有色的物质其特点就更为突出。

硅胶、键合固定相(如C18)、离子交换树脂 、聚酰胺、 氧化铝、 凝胶等都可以作为色谱柱的填料。 有不少文献报道，对填料可以进行一下处理提高了分离效果，如，对硅胶进行的硝酸银(或缓冲液)处理。

1 制备色谱到底是什么?

(1)分析色谱的目的，是分析出混合物中一个(或者几个)纯物质的含量。制备色谱的目的，是从混合物中得到纯物质。

为了加快分离的时间与提高分离的效率，制备色谱的的进样品量很大，导致制备色谱柱子的分离负荷的相应加大，也就必须加大色谱柱填料，增大制备色谱的直径和长度，使用的相对多的流动相。

然而，当色谱柱上样品负载加大的时候，往往导致柱效急剧下降而得不到纯的产品。制备色谱，要解决容量与柱子效果之间的矛盾，对重现性也要考虑。从经济上来说。制备色谱要争取少用填料，少用溶剂，要尽可能多的得到产品。

(2)样品的前处理:

制备色谱柱子由于处理的样品多，比分析柱子更容易受污染，所以，必要的前处理就显得非常的必要。萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法，如果用得上，而且还不是很麻烦，就要尽可能多的采用以去掉杂质。

(3)固定相的选择

硅胶、键合固定相(如C18)、离子交换树脂、聚酰胺、氧化铝、凝胶等都可以作为色谱柱的填料。 有不少文献报道，对填料可以进行一下处理提高了分离效果，如，对硅胶进行的硝酸银(或缓冲液)处理。

(4)装柱方法的选择 根据固定相颗粒度和柱子的尺寸，采用不同的装柱方法，往往装填越好分离效果越好。装柱效果跟填料的颗粒度关系很大，颗粒度的减少会导致装柱的难度。一般来说，颗粒直径小于20-30um的固定相采用湿法装填。所谓"敲击-装填"技术适用于颗粒直径大于25um的固定相。湿法的目的是迫使相对稀松的 固定相悬浆以高速装入色谱柱子，从而减少空隙的形成。然而，当柱直径大于20mm，所加压力为30-40bar时，高压悬浆装填技术就变得十分复杂。为将小颗粒固定相装入更大得制备型色谱柱，可采用柱长压缩技术。这种方法，先将固定相悬浆(或偶尔是干填充物)装入柱中加压，利用物理方法将其压紧。压紧的方法有两种:径向压缩和轴向压缩。 湿法装柱需要一定的设备，在柱子填完后，应用有柱效的测量，对柱效低的柱子应该重填。

(5)流动相的选择

除了和分析色谱同样的考虑外，在选用流动相时，要考虑色谱分离后面加有旋转蒸发等二次分离操作。一般来说，不宜采用高毒性溶剂，对多元溶剂要尽可能的少用。

如果产品中含有大量溶剂，溶剂的纯度也要考虑在其中。

(6)加样的方法

可以采用以下方法之一进样。-用注射器进样-用旋转阀进样-通过六通阀进样-通过主泵进样-通过辅泵进样-固体上样

(7) 泵的选用

生产制备色谱泵的厂商很多。根据有无脉冲、能承受的最大压力、控制的精度、售后服务等来选择泵。

(8)检测器的选用

一般的分析池的最大允许流速仅为5 mL/min 或者10mL/min。而专门的制备池的最大允许流速可为150mL/min。有时，采用旁路分离管，将少量流体导入分析池进行检测，是一个不错的办法，但其浓度的误差会相对较大。

(9)组分保留时间的估计

用分析柱子在同等色谱条件下(同样的固定相和流动相)测定保留时间后，按照单一组分的线流速(不是体积流速)一定，通过计算可以知道组分的大致保留时间区域。

分析谱图的峰形状，对确定保留时间也有很大的参考价值。

(10)产品的收集

手工馏分收集费时费力，自动馏分收集器有很大的方便。许多实验室和工厂都采用了馏分收集器。

(11)超载、边缘切割、中心切割、放大技术与非线性效用

在制备色谱中，因为没有必要达到分析色谱那样的分离度，可以在一定范围内大大加大进样的浓度和体积。在做分离的时候，也有一些分析色谱的时候，不能用到的技巧。因为篇幅关系，不在这里叙述。

(12)柱转换技术

通过接头或者阀门，实现柱子的简单延长，或者比较方便地实现对其中一个(或几个)组分的精制。

(13)比较新的制备色谱技术

模拟移动床可以连续进样，并可以利用边缘切割效用，而且采用了柱切换技术，能更好的利用溶剂和填料，已经应用于工业化生产。其理论和技术也日益完善。

迎头色谱、超临界流体色谱、逆流色谱环形色谱、气相制备色谱等在科研和工业生产中也得到了应用。