稀释与接种法(HJ 505-2009)
本标准参照采用国际标准ISO5815--1983，本国家标准规定采用稀释与接种法作为测定水中生化需氧量的标准方法，这是一种经验性的常规方法。
适用范围:本方法适用于BOD5或等于2mg/L并且不超过6000mg/L的水样。BOD5大于6000mg/L的水样仍可用本方法，但由于稀释会造成误差，有必要要求对测定结果做慎重的说明。本试验得到的结果是生物化学和化学作用共同产生的结果，它们不象单一的、有明确定义的化学过程那样具有严格和明确的特性，但是它能提供用于评价各种水样质量的指标。本试验的结果可能会被水中存在的某些物质所干扰，那些对微生物有毒的物质，如杀菌剂、有毒金属或游离氯等，会抑制生化作用。水中的藻类或硝化微生物也可能造成虚假的偏高结果。
原理:将水样注满培养瓶，塞好后应不透气，将瓶置于恒温条件下培养5天。培养前后分别测定溶解氧浓度，由两者的差值可算出每升水消耗掉氧的质量，即BOD5值。由于多数水样中含有较多的需氧物质，其需氧量往往超过水中可利用的溶解氧(DO)量，因此在培养前需对水样进行稀释，使培养后剩余的溶解氧(DO)符合规定。一般水质检验所测BOD5只包括含碳物质的耗氧量和无机还原性物质的耗氧量。有时需要分别测定含碳物质耗氧量和硝化作用的耗氧量。常用的区别含碳和氮的硝化耗氧的方法是向培养瓶中投加硝化抑制剂，加入适量硝化抑制剂后，所测出的耗氧量既为含碳物质的耗氧量。在5天培养时间内，硝化作用的耗氧量取决于是否存在足够数量的能进行此种氧化作用的微生物，原污水或初级处理的出水中这种微生物的数量不足，不能氧化显著量的还原性氮，而许多二级生化处理的出水和受污染较久的水体中，往往含有大量硝化微生物，因此测定这种水样时应抑制其硝化反应。在测定BOD5的同时，需要葡萄糖和谷氨酸标准溶液完成验证试验。
试剂:分析时，只采用公认的分析纯试剂和蒸馏水或同等纯度的水(在全玻璃装置中蒸馏的水或去离子水)，水中含铜不应高于0.01mg/L，并不应有氯、氯氨、可性碱、有机物和酸类。
1接种水
如试验样品本身不含有足够的合适性微生物，应采用下述方法之一，以获得接种水:
a.城市废水，取自污水管或取自没有明显工业污染的住宅区污水管。
这种水在使用前，应倾出上清夜备用。
b.在1L水中加入100g花园土壤，混合并静置10min。取10ml上清夜用水稀释至1L。
c.含有城市污水的河水或湖水。
d.污水处理厂出水。
e.当待分析水样为含难降解物质的工业废水时，取自待分析水排放口下游约3-8km的水或所含微生物适宜于待分析水并经实验室培养过的水
2盐酸液
下述溶液至少可稳定一个月，应贮存在玻璃瓶内，置于暗处。一旦发现有生物滋长迹象，则应弃去不用。
2.1磷酸盐:缓冲溶液。
降8.5g磷酸二氢钾(KH2PO4)、21.75g磷酸氢二钾(K2HPO4)、33.4g七水磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O)和1.7g氯化铵(NH4CI)溶于约500ml水中，稀释至1000ml并混合均匀。
此缓冲溶液的pH应为7.2。
2.2七水硫酸镁:22.5g/L溶液。
将22.5g的七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶于水中，稀释至1000ml并混合均匀。
2.3氯化钙:27.5g/L溶液。
将27.5g的无水氯化钙(CaCl2)(若用水合氯化钙，要取相当的量)溶于水，稀释至1000ml并混合均匀。
2.4六水氯化铁(FeCl3·6H2O):0.25g/L溶液。
将0.25g六水氯化铁(FeCl3·6H2O)溶解于水中，稀释至1000ml并混合均匀。
3稀释水
取每种盐溶液各1ml，加入约500ml水中，然后稀释至1000m并混合均匀，将此溶液置于20oC下恒温，曝气1h以上，采取各种措施，使其不受污染，特别是不被有机物质、氧化或还原性物质或金属污染，确保溶解氧浓度不低于8mg/L。此溶液的五日生化需氧量不得超过0.2mg/L。此溶液应在8h内使用。
4接种的稀释水
根据需要和接种水的来源，向每升稀释水中加1.0-5.0ml接种水，将已接种的稀释水在约20oC下保存，8h后尽早应用。已接种的稀释水的5天(20oC)耗氧量应在每升0.3-1.0mg之间。
5盐酸(HCl)溶液:0.5g/L。
6氢氧化钠(NaOH)溶液:20g/L。
7亚硫酸钠(NaSO3)溶液:1.575g/L，此溶液不稳定，需每天配制。
8葡萄糖–谷氨酸标准溶液。
将一些无水葡萄糖(C6H12O6)和一些谷氨酸(HOOC–CH2–CH2–CHNH2–COOH)在103oC下干燥1h，每种称量150±1mg，溶于蒸馏水中，稀释至1000ml并混合均匀。此溶液于临用前配制。
仪器
使用的玻璃器皿要认真清洗，不能吸有毒的或生物可解物的化合物，并防止沾污。常用的实验室设备如下:
1培养瓶:细口瓶的容量在250-300ml之间，带有磨口玻璃塞，并具有供水封用的钟型口，最好是直尖的。
2培养箱:能控制在20±1oC。
3测定溶解氧仪器。
4用于样品运输和贮藏的冷藏手段(0-4oC)。
5稀释容器:带塞玻璃瓶，刻度精确到毫升，其容积大小取决于使用稀释水样品的体积。
样品的贮存
样品需充满并密封于瓶中，置于2-5oC保存到进行分析时。一般应在采样后6h内进行检验。若需远距离转运，在任何情况下贮存皆不得超过24h。样品也可以深度冷冻贮存。
操作步骤
1样品预处理
1.1样品的中和
如果样品的PH不在6-8之间，先做单独试验，确定需要用的盐酸溶液或氢氧化钠溶液的体积，再称样品，不管有无沉淀形成。
1.2含游离氯或结合氯的样品
加入所需体积的氢氧化钠溶液，使样品中自由氯和结合氯失效，注意避免过量。
2试验水样的准备
将试验样品温度升至约20oC，然后再半充满的容器内摇动样品，以便消除可能存在的过饱和氧。
将已知体积样品置于稀释容器中，用稀释水或接种稀释水稀释，轻轻地中和，避免夹杂空气泡。
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