尿液:离心

组织:用柱层析法预纯化。

饲料:酸化，中和离心。

样品处理需要的时间:(10个样品)

饲料……………………………60分钟

尿液……………………………10分钟

组织……………………………6小时

测试时间: 约1小时

8.1尿样以2500转离心10分钟后取上清部分(清亮部分)用于检测。若尿样呈浑浊状，需先用滤纸过滤，否则会影响测定数值。本试剂盒的标准曲线及计算(采用曲线定量), 与德国Bio-pharm公司一致。反应体系加液量为20μl样品: 100μl酶液。(见第4页尿样快速检测程序)。

8.2.1带有低脂肪的肝，肉，或组织

…5g粉碎的样品与25ml 50mM HCL 混合，振荡1.5小时，匀浆。

…称6g匀浆物(相当于1g肝脏)，加入离心管中。

…10-15℃以4000转/分或更高速，离心15分钟

…转移上清液到另一个离心管中，加300μl 1MNaOH 混合15分钟。

…加入4ml 500mM磷酸二氢钾缓冲液(pH3.0)，简单的混合后放置4℃至少1.5小时或过夜。

…10-15℃以4000转/分或更高速，离心15分钟。分离全部上清液(应该是清亮的)，使其升至室温(20-25℃)，然后用C18柱纯化(见C18柱纯化步骤)。

8.2.2 肉和组织

…5g 粉碎的样品与25ml50mM Tris 缓冲液pH8.5混合，振荡0.5小时，匀浆。

…加入15ml庚烷(n-heptane)振荡5分钟除去脂肪。

…4000g或更高的速度10-15℃离心5分钟

…用巴斯德吸管除去上面的庚烷层及中间薄薄的脂肪层

…再用15ml庚烷(n-heptane)重复步骤2-4

…向匀浆的肉液中加入0.5ml半浓的盐酸，振荡1小时

…称6g均质物(相当于1g肝脏)，加入离心管中。

…以下从8.2.1的第一个离心步骤开始，像处理肝脏一样继续进行处理。

C18柱以下列方式纯化

所有试剂和样品处理必须在室温条件下(20-25℃)并严格控制过柱时的流速。

…用3ml甲醇(100%)洗涤柱子，流速为1滴/每秒

…用2ml洗涤液洗涤柱子(50mM磷酸二氢钾缓冲液pH3.0)

…样品进柱(肝，肉，或组织的全部上清液)

…用2ml洗涤液洗涤柱子(50mM磷酸二氢钾缓冲液pH3.0)

…用正压去除残留的流体并且用空气或氮气吹2分钟干燥柱子

…用2ml甲醇(100%)洗脱样品，流速为15滴/分钟

…在50-60℃并且在弱空气或氮气流下完全蒸发溶剂

…用1ml蒸流水溶解干燥的残留物，取50μl进行分析

注意:

样品的保存

…未处理的样品冷冻保存

…HCL匀浆后的样品在2-8℃稳定3天

…以磷酸二氢钾缓冲液提取后的样品(C18柱纯化之前)在2-8℃稳定2天，使用前需离心。

…C18柱纯化步骤6所获得的甲醇洗脱物可以冷冻保存数周，在2-8℃稳定2周。

…用蒸馏水溶解的干燥残留物(步骤8)在2-8℃稳定1周。

C、操作步骤

本产品的酶标记物与克伦特罗标准溶液均直接使用，无需再稀释。

1、于适当微孔中分别加入100mL标准溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。

2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前处理的样品溶液。

3、再于每一微孔中另再加入50mL酶标记物。

4、轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温下避光静置温育1小时。

5、将微孔中的反应液甩掉，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复洗3次。

6、最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。

7、于每一微孔中加入底物溶液100mL后，轻敲盘子四周，使其充分混合。

8、于室温下避光静置温育20分钟。

9、于每一微孔中加入100mL反应终止液。

10、用化学发光仪于下判读。

D、判定

1. 计算B/B0值。用样品或标准液吸光度值(B)除以零标准吸光度值(B0)再乘以100%。

2. 以B/B0值为纵坐标，以标样浓度的对数值为横坐标，做标准半对数曲线。

3. 根据每个样品的B/B0值就可从曲线上读出相对应样品的浓度。

4. 由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。

H、再现性

针对克伦特罗检测试剂盒精密度测试，重复6次，所得不同浓度标准溶液的吸光值变异系数(%CV).