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生物科学技术中,传统膜片钳及卵母细胞双电极记录、脂双层单通道记录等电生理学实验技术所需的仪器设备较多。在多数情况下,这样一套完整的技术系统,不仅在购买时仪器设备的配置比较烦琐,而且在使用时这些仪器设备的功能也较为复杂。正确掌握仪器的使用方法是获得可靠科研数据至关重要的环节,有鉴于此,笔者多方查阅了膜片钳及相关实验仪器的资料,同时结合多年在具体实验中获得的仪器使用经验,撰写了《膜片钳及相关实验仪器的使用》,希望能为国内科研人员在膜片钳及相关仪器的使用上提供有效的帮助。
《膜片钳及相关实验仪器的使用》共分四章,包括电刺激器、玻璃微电极拉制仪、放大器及数模/模数转换器,以及其他相关仪器设备,共介绍了20多种仪器设备的特点、功能与使用方法。
《膜片钳及相关实验仪器的使用》在选择仪器设备时,入选的多是膜片钳及相关电生理学实验室常用的,而且不易为使用者熟练掌握或某些功能不为使用者所知和利用的仪器设备。一些常用且功能较为复杂的膜片钳放大器,如Axopatch200B、MultiClamp700B以及EPC10USB,在《实用膜片钳技术》第二版中已有详细讲解,《膜片钳及相关实验仪器的使用》不再介绍。
《膜片钳及相关实验仪器的使用》对仪器的工作原理涉及较少,重点介绍了仪器的使用方法和操作步骤,对仪器的功能也尽可能做了详尽说明,因唯有熟知其功能,才能更好地掌握仪器的使用方法。此外,对某些仪器(如刺激器、放大器)与其他仪器和软件的配套使用方法也做了重点讲述。与《实用膜片钳技术》一样,《膜片钳及相关实验仪器的使用》亦侧重实用,力图在书中详尽讲述仪器的使用方法,使科研人员参照《膜片钳及相关实验仪器的使用》能够快速地掌握仪器的基本操作。
《膜片钳及相关实验仪器的使用》可作为实验室技术人员和学生的科研实验参考书、实验室购置卵母细胞双电极电压钳记录系统和平面脂双层记录系统仪器设备的指导用书,还可作为经销电生理实验设备的销售人员和工程师的业务用书。
第一章 电刺激器
第一节 Master-8程控脉冲刺激器
一、简介
二、前后面板
三、刺激模式与刺激参数的含义
四、刺激模式与刺激参数设置
五、触发
六、处理paradigm
七、设置的检查
八、计时选择
九、Master-8-cp
十、实例-LTP诱发实验中刺激参数的设置
十一、刺激输出
十二、同步触发
第二节 Master-9程控脉冲刺激器
一、简介
二、前后面板
三、刺激模式与刺激参数的含义
四、刺激模式与刺激参数设置
五、触发
六、显示其他channel的参数
七、处理paradigm
八、用channel 9输出刺激波形
九、计时设备
十、使用计算机编程
十一、实例-LTP诱发实验中刺激参数的设置
十二、刺激输出
十三、同步触发
第三节 Model 2100型隔离式脉冲刺激器
一、简介
二、功能钮
三、刺激参数设置
四、常见问题
五、实例-LTP诱发实验中刺激参数的设置
六、刺激输出
七、同步触发
第四节 Model 3800型程控脉冲刺激器
一、简介
二、前后面板
三、刺激参数
四、触发
五、触摸屏
六、软件设置
七、实例-LTP诱发实验中刺激参数的软件设置
八、刺激输出
九、同步触发
……
第二章 玻璃微电极拉制仪
第三章 放大器及数模/模数转换器
第四章 其他相关仪器设备2100433B
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电生理膜片钳设备汇编
电生理膜片钳设备汇编
(1). 膜片钳技术在通道研究中的重要作用
应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性、同时可发现新的离子通道及亚型,并能在记录单细胞电流和全细胞电流的基础上进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率,还可以用以研究某些胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。同时用于研究细胞信号的跨膜转导和细胞分泌机制。结合分子克隆和定点突变技术,膜片钳技术可用于离子通道分子结构与生物学功能关系的研究。
利用膜片钳技术还可以用于药物在其靶受体上作用位点的分析。如神经元烟碱受体为配体门控性离子通道,膜片钳全细胞记录技术通过记录烟碱诱发电流,可直观地反映出神经元烟碱受体活动的全过程,包括受体与其激动剂和拮抗剂的亲和力,离子通道开放、关闭的动力学特征及受体的失敏等活动。使用膜片钳全细胞记录技术观察拮抗剂对烟碱受体激动剂量效曲线的影响,来确定其作用的动力学特征。然后根据分析拮抗剂对受体失敏的影响,拮抗剂的作用是否有电压依赖性、使用依赖性等特点,可从功能上区分拮抗剂在烟碱受体上的不同作用位点,即判断拮抗剂是作用在受体的激动剂识别位点,离子通道抑或是其它的变构位点上。
(2).与药物作用有关的心肌离子通道
心肌细胞通过各种离子通道对膜电位和动作电位稳态的维持而保持正常的功能。国外学者在人类心肌细胞离子通道特性的研究中取得了许多进展,使得心肌药理学实验由动物细胞模型向人心肌细胞成为可能。
(3).对离子通道生理与病理情况下作用机制的研究
通过对各种生理或病理情况下细胞膜某种离子通道特性的研究,了解该离子的生理意义及其在疾病过程中的作用机制。如对钙离子在脑缺血神经细胞损害中作用机制的研究表明,缺血性脑损害过程中,Ca2+ 介导现象起非常重要的作用,缺血缺氧使Ca2+通道开放,过多的Ca2+进入细胞内就出现Ca2+超载,导致神经元及细胞膜损害,膜转运功能障碍,严重的可使神经元坏死
(4).对单细胞形态与功能关系的研究
将膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链是反应技术结合,在全细胞膜片钳记录下,将单细胞内容物或整个细胞(包括细胞膜)吸入电极中,将细胞内存在的各种mRNA全部快速逆转录成cDNA,再经常规PCR扩增及待检的特异mRNA的检测,借此可对形态相似而电活动不同的结果做出分子水平的解释或为单细胞逆转录多聚酶链式反应提供标本,为同一结构中形态非常相似但功能不同的事实提供分子水平的解释。国际上掌握此技术的实验室较少,我国北京大学神经科学研究所于1994年在国内率先开展。
(5).对药物作用机制的研究
在通道电流记录中,可分别于不同时间、不同部位(膜内或膜外)施加各种浓度的药物,研究它们对通道功能的可能影响,了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物生理功能的分子机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域,既有对西药药物机制的探讨,也广泛用在重要药理的研究上。如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通道记录法观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和"缺血"诱导的大鼠大脑皮层神经元L-型钙通道的开放,从而减少钙内流,对缺血细胞可能有保护作用。陈龙等报道采用细胞贴附式单通道记录法发现乌头碱对培养的Wistar大鼠心室肌细胞L-型钙通道有阻滞作用。
(6). 在心血管药理研究中的应用
随着膜片钳技术在心血管方面的广泛应用,对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了不断更新,而且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的观点。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说:"Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理,为研制新的更为特效的药物开辟了道路"。
(7). 创新药物研究与高通量筛选
在离子通道高通量筛选中主要是进行样品量大、筛选速度占优势、信息量要求不太高的初级筛选。最近几年,分别形成了以膜片钳和荧光探针为基础的两大主流技术市场。将电生理研究信息量大、灵敏度高等特点与自动化、微量化技术相结合,产生了自动化膜片钳等一些新技术。
(8). 与非损伤微测技术(NMT)的结合应用
1919年,J.J.汤姆逊让位于他的学生卢瑟福。卢瑟福是一位成绩卓著的实验物理学家,是原子核物理学的开创者。卢瑟福更重视对青年人的培养。在他的带领下,查德威克发现了中子,考克拉夫特和瓦尔顿发明静电加速器,布拉凯特观察到核反应,奥利法特发现氰,卡皮查在高电压技术和低温研究取得硕果,另外还有电离层的研究,空气动力学和磁学的研究等等。
1937年,卢瑟福去世后,由W.L.布拉格继任第五届教授,以后是莫特和皮帕德。七十年代以后,古老的卡文迪许实验室大大地扩建了,研究的领域包括天体物理学,粒子物理学,固体物理以及生物物理等等。卡文迪许实验室至今仍不失为世界著名实验室之一。
应该指出,卡文迪许实验室之所以能在近代物理学的发展中做出这么多的贡献,有它特定的时代背景和社会条件,但是它创造的经验还是很值得人们吸取和借鉴的。
膜片钳放大器可以配 5101-01G(1 GΩ)探头等三种探头,适用于电流为±10 nA范围内的单通道测定和整体细胞研究,特点有:具有独立的电压和电流电路,4级低通Bessel滤波器。具有Zap功能和内部检测信号,三种电流钳响应速度增加了大型膜片钳的稳定性。
这个系统包含的PowerLab数据采集分析系统可以实时记录各种神经信号,单通道最高采样速率可达200k/s。