以SDS法提取的结缕草(Zoysia spp.)叶片DNA为模板,应用正交试验设计,从Mg2+、dNTP、引物和DNA聚合酶并通过比较不同浓度的模板DNA对PCR扩增的影响,确立结缕草属植物ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:各因素不同浓度对PCR反应结果有显著影响,正交设计可以用于ISSR反应体系建立,该方法建立的结缕草属植物ISSR-PCR优化反应体系为10X Buffer7、0 ng模板DNA、Mg2+2.0 mmol.L-1、dNTP 150μmol.L-1、Primer 0.3μmol.L-1、Taq DNA聚合酶1.0 U,总体积20μL;经对11份结缕草属植物进行检验,证明该体系稳定可靠。该体系的建立可为今后利用ISSR标记技术进行结缕草属遗传多样性研究、种质资源鉴定和亲缘关系分析等提供依据。

以SDS法提取的结缕草属植物叶片DNA为模板,分别采用单因子试验和正交设计试验2种方法,对影响结缕草属植物SRAP-PCR的Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA五个因素进行优化试验。单因子试验分别研究各因素在多水平条件下对SRAP-PCR反应体系的影响,得到最佳反应条件。正交设计采用L16(45)方案,综合考虑各因素间的相互作用,通过直观分析法获得各影响因素的最佳反应水平。根据4对引物对6份结缕草属植物材料扩增结果的验证比较,2种方法所获得的最佳反应体系存在一定的差异。通过综合比较和分析2种方法的优化体系扩增出的条带数、多态性条带数及多态性比率,最终建立了结缕草属植物SRAP-PCR的最佳反应体系:Mg2+2.00 mmol/L、dNTP 220μmol/L、引物0.20μmol/L、Taq DNA聚合酶0.50 U、模板DNA 60 ng、2μL 10×buffer,总体积为20μL。这一优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术进行结缕草属植物遗传多样性、种质鉴定、遗传连锁图谱及亲缘关系分析等方面的研究提供了科学的依据。