柱色谱是在一根玻璃管或金属管中迸行的色谱技术，将吸附剂填充到管中而使之成为柱状，这样的管状柱称为吸附色谱柱。使用吸附色谱柱分离混合物的方法，称为吸附柱色谱。这种方法可以用来分离大多数有机化合物，尤其适合于复杂的天然产物的分离。分离容量从几毫克到百毫克级，所以，适用于分离和精制较大量的样品。

在吸附柱色谱中，吸附剂是固定相，洗脱剂是流动相，相当于薄层色谱中的展开剂。吸附剂的基本原理与吸附薄层色谱相同，也是基于各组分与吸附剂间存在的吸附强弱差异，通过使之在柱色谱上反复进行吸附、解吸、再吸附、再解吸的过程而完成的。所不同的是，在进行柱色谱的过程中，混合样品一般是加在色谱柱的顶端，流动相从色谱柱顶端流经色谱柱，并不断地从柱中流出。由于混合样中的各组分与吸附剂的吸附作用强弱不同，因此各组分随流动相在柱中的移动速度也不同，最终导致各组分按顺序从色谱柱中流出。如果分步接收流出的洗脱液，便可达到混合物分离的目的。一般与吸附剂作用较弱的成分先流出，与吸附作用较强的成分后流出。

根据待分离组分的结构和性质选择合适的吸附剂和洗脱剂是分离成败的关键。

1. 吸附剂的要求

一种合适的吸附剂，一般应满足下列几个基本要求:

⑴对样品组分和洗脱剂都不会发生任何化学反应，在洗脱剂中也不会溶解。

⑵对待分离组分能够进行可逆的吸附，同时具有足够的吸附力，使组分在固定相与流动相之间能最快地达到平衡。

⑶颗粒形状均匀，大小适当，以保证洗脱剂能够以一定的流速 (一般为1.5 mL·min-1)通过色谱柱。

⑷材料易得，价格便宜而且是无色的，以便于观察。可用于吸附剂的物质有氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙 (镁)、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。其中有些对几类物质分离效果较好，而对其它大多数化合物不适用。

2. 几种常见吸附剂

⑴氧化铝: 市售的层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型，粒度规格大多为100~150目。

碱性氧化铝 (pH 9-10)适用于碱性物质 (如胺、生物碱)和对酸敏感的样品(如缩醛、糖苷等)，也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。所以，这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。

酸性氧化铝 (pH 3.5-4.5)适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等的分离。

中性氧化铝 (pH 7-7.5)适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。

⑵硅胶: 硅胶是硅酸的部分脱水后的产物，其成分是SiO2·xH2O，又叫缩水硅酸。柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。

⑶聚酰胺: 聚酰胺是聚己内酰胺的简称，商业上叫做锦纶、尼龙-6或卡普纶。色谱用聚酰胺是一种白色多孔性非晶形粉末，它是用锦纶丝溶于浓盐酸中制成的(制法详见附录十)。不溶于水和一般有机溶剂，易溶于浓无机酸、酚、甲酸及热的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中。聚酰胺分子表面的酰氨基和末端胺基可以和酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成强度不等的氢键，因此可以分离上述化合物，也可以分离含羟基、氨基、亚氨基的化合物及腈和醛等类化合物。

⑷硅酸镁: 中性硅酸镁的吸附特性介于氧化铝和硅胶之间，主要用于分离甾体化合物和某些糖类衍生物。为了得到中性硅酸镁，用前先用稀盐酸，然后用醋酸洗涤，最后用甲醇和蒸馏水彻底洗涤至中性。

3. 吸附剂的活度及其调节

吸附剂的吸附能力常称为活度或活性。吸附剂的活性取决于它们含水量的多少，活性最强的吸附剂含有最少的水。吸附剂的活性一般分为五级，分别用I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V表示。数字越大，表示活性越小，一般常用Ⅱ和Ⅲ。向吸附剂中添加一定的水，可以降低其活性;反之，如果用加热处理的方法除去吸附剂中的部分水，则可以增加其活性，后者称为吸附剂的活化。

4.吸附剂和洗脱剂的选择

样品在色谱柱中的移动速度和分离效果取决于吸附剂对样品各组分的吸附能力大小和洗脱剂对各组分的解吸能力大小，因此，吸附剂的选择和洗脱剂的选择常常是结合起来进行的。首先，根据待分离物质的分子结构和性质，结合各种吸附剂的特性，初步选择一种吸附剂。然后根据吸附剂和待分离物质之间的吸附力大小，选择出认为适宜的洗脱剂。最后，采用薄层色谱法进行试验。根据试验结果，再进一步决定是调节吸附剂的活性，还是更换吸附剂的种类，或是改变洗脱剂的极性。直到确定出合适的吸附剂和洗脱剂为止。

物质与吸附剂之间的吸附能力大小既与吸附剂的活性有关，又与物质的分子极性有关。分子极性越强，吸附能力越大，分子中所含极性基团越多，极性基团越大，其吸附能力也就越强。具有下列极性基团的化合物，其吸附能力按下列次序递增:

-Cl，-Br，-I<-C=C-<-OCH3<-CO2R<-CO-<-CHO<-SH<-NH2<-OH<-COOH

1. 装柱

色谱柱的大小规格由待分离样品的量和吸附难易程度来决定。一般柱管的直径为0.5~l0 cm，长度为直径的10~40倍。填充吸附剂的量约为样品重量的20~50倍，柱体高度应占柱管高度的3/4，柱子过于细长或过于粗短都不好。装柱前，柱子应干净、干燥，并垂直固定在铁架台上，将少量洗脱剂注入柱内，取一小团玻璃毛或脱脂棉用溶剂润湿后塞入管中，用一长玻璃棒轻轻送到底部，适当捣压，赶出棉团中的气泡，但不能压得太紧，以免阻碍溶剂畅流 (如管子带有筛板，则可省略该步操作)。再在上面加入一层约0.5 cm厚的洁净细砂，从对称方向轻轻叩击柱管，使砂面平整。

常用的装柱方法有干装法和湿装法两种。

⑴干装法:在柱内装入2/3溶剂，在管口上放一漏斗，打开活塞，让溶剂慢慢地滴入锥形瓶中，接着把干吸附剂经漏斗以细流状倾泻到管柱内，同时用套在玻璃棒 (或铅笔等)上的橡皮塞轻轻敲击管柱，使吸附剂均匀地向下沉降到底部。填充完毕后，用滴管吸取少量溶剂把粘附在管壁上的吸附剂颗粒冲入柱内，继续敲击管子直到柱体不再下沉为止。柱面上再加盖一薄层洁净细砂，把柱面上液层高度降至0.1~l cm，再把收集的溶剂反复循环通过柱体几次，便可得到沉降得较紧密的柱体。

⑵湿装法:基该方法与干装法类似，所不同的是，装柱前吸附剂需要预先用溶剂调成淤浆状，在倒入淤浆时，应尽可能连续均匀地一次完成。如果柱子较大，应事先将吸附剂泡在一定量的溶剂中，并充分搅拌后过夜 (排除气泡)，然后再装。无论是干装法，还是湿装法，装好的色谱柱应是充填均匀，松紧适宜一致，没有气泡和裂缝，否则会造成洗脱剂流动不规则而形成"沟流"，引起色谱带变形，影响分离效果。

2. 加样

将干燥待分离固体样品称重后，溶解于极性尽可能小的溶剂中使之成为浓溶液。将柱内液面降到与柱面相齐时，关闭柱子。用滴管小心沿色谱柱管壁均匀地加到柱顶上。加完后，用少量溶剂把容器和滴管冲洗净并全部加到柱内，再用溶剂把粘附在管壁上的样品溶液淋洗下去。慢慢打开活塞，调整液面和柱面相平为止，关好活塞。如果样品是液体，可直接加样。

3. 洗脱与检测

将选好的洗脱剂沿柱管内壁缓慢地加入柱内，直到充满为止 (任何时候都不要冲起柱面覆盖物)。打开活塞，让洗脱剂慢慢流经柱体，洗脱开始。在洗脱过程中，注意随时添加洗脱剂，以保持液面的高度恒定，特别应注意不可使柱面暴露于空气中。在进行大柱洗脱时，可在柱顶上架一个装有洗脱剂的带盖塞的分液漏斗或倒置的长颈烧瓶，让漏斗颈口浸入柱内液面下，这样便可以自动加液。如果采用梯度溶剂分段洗脱，则应从极性最小的洗脱剂开始，依次增加极性，并记录每种溶剂的体积和柱子内滞留的溶剂体积，直到最后一个成分流出为止。洗脱的速度也是影响柱色谱分离效果的一个重要因素。大柱一般调节在每小时流出的毫升数等于柱内吸附剂的克数。中小型柱一般以1~5滴/秒的速度为宜。

洗脱液的收集，有色物质，按色带分段收集，两色带之间要另收集，可能两组分有重叠。对无色物质的接收，一般采用分等份连续收集，每份流出液的体积毫升数等于吸附剂的克数。若洗脱剂的极性较强，或者各成分结构很相似时，每份收集量就要少一些，具体数额的确定，要通过薄层色谱检测，视分离情况而定。现在，多数用分步接受器自动控制接收。

洗脱完毕，采用薄层色谱法对各收集液进行鉴定，把含相同组分的收集液合并，除去溶剂，便得到各组分的较纯样品。

色谱法按固定的状态可分为柱色谱.平板色谱和棒色谱三种而实验室中最常用的是柱层析和薄层层析，以及它们之间的配合应用。

吸附色谱的原理:在一定条件下，硅胶与被分离物质之间产生作用，这种作用主要是物理和化学作用两种.物理作用来自于硅胶表表面与溶质分子之间的范德华力.化学作用主要是硅胶表面的硅羟基与待分离物质之间的氢键作用。色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装入吸附剂。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果。除另有规定外，通常多采用直径为0.07~0.15mm的颗粒。色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，均按各品种项下的规定。

⑴ 吸附剂的填装

①干法 将吸附剂一次加入色谱柱，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入洗脱剂;或在色谱柱下端出口处连接活塞，加入适量的洗脱剂，旋开活塞使洗脱剂缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。

②湿法 将吸附剂与洗脱剂混合，搅拌除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，然后加入洗脱剂将附着管壁的吸附剂洗下，使色谱柱面平整。等到填装吸附剂所用洗脱剂从色谱柱自然流下，液面和柱表面相平时，即加供试品液。

⑵ 供试品的加入

除另有规定外，将供试品溶于开始洗脱时使用的洗脱剂中，再沿色谱管壁缓缓加入，注意勿使吸附剂翻起。或将供试品溶于适当的溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽使呈松散状，加在已制备好的色谱柱上面。如供试品在常用溶剂中不溶，可将供试品与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。

⑶ 洗脱

除另有规定外，通常按洗脱剂洗脱能力大小递增变换洗脱剂的品种和比例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变洗脱剂的品种和比例。操作过程中应保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。

方法和吸附柱色谱基本一致。装柱前，先将载体和固定液混合，然后分次移入色谱柱中并用带有平面的玻棒压紧;供试品可溶于固定液，混以少量载体，加在预制好的色谱柱上端。洗脱剂需先加固定液混合使之饱和，以避免洗脱过程中两相分配的改变。

色谱已有100余年的历史，它一开始就是为制备性分离而产生的，其目的在于分离制备一种或多种纯组分。虽然制备型色谱的研究目前处于一个相对平稳的阶段，但其应用却仍方兴未艾，常压柱色谱、低压柱色谱、中压制备色谱、高压制备液相色谱等仍是现代科学研究及生产实践中不可取代的制备性分离手段。一些专门进行有机合成的工作者往往一年可利用上百根色谱柱进行合成产物的制备性分离，甚至一天之内可进行三次以上的柱色谱操作;一些植物化学工作者70%以上的实验时间是用在使用制备色谱进行分离之上;在一些多肽、多糖、蛋白质、手性药物以及天然产物等的生产上，现代制备色谱是其必不可少的分离单元。

制备色谱技术在大多数情况下是在非线性条件下进行工作，它的理论深奥、公式复杂、进样量大、固定相和溶剂量多、成本较高，分离过程中常常因为操作者技术水平方面的原因达不到预期的制备性分离目的。其与线性条件下的色谱分析相比往往具有很大的不同，并且有些制备色谱技术本身只具备制备的特点。制备色谱技术包括了从实验室分离几毫克至几克样品的小型制备色谱直至工业用大规模制备纯物质的生产制备色谱。

本书的撰写紧紧围绕制备色谱的基础理论，避免制备色谱理论中繁杂的数学推导，充分注重方法的可操作性和实用性，比较系统、全面、详细地介绍多种制备色谱技术。第二版对各章进行了不同程度的调整或者补充，完善了不足的部分，加强了色谱操作技术;扩展了凝胶色谱，充实了高速逆流色谱的pH区带提取、手性分离、粒子分离章节;新增了大孔吸附柱色谱、台锥形柱色谱、二维高压制备液相色谱、膜分离等较多内容。但读者要系统地了解色谱基础理论和知识，至少仍需阅读本丛书中的《色谱分析概论》(第二版)分册。

本书是在本人近30年的科研和教学实践基础上写成的，部分内容受到国家自然科学基金(No.29665001、No.30160092、No.20775066、No.21075109)、教育部第三届"高校青年教师奖"(No.2001298)、云南省重点项目(No.2005E0006Z、No.99YBL-04)等10余个课题的资助。书中的较多素材直接取材于本人的研究或者与本人研究密切相关的资料文献，并与本人所编著的《手性识别材料》(科学出版社，2010)具有很好的相关性。

衷心感谢我的硕士生导师--云南大学宋文俊教授、博士生导师--北京理工大学傅若农教授、博士后导师--日本名古屋大学Y. Okamoto教授，是他们将我带入"手性识别材料及技术"领域，进行探索性的研究工作。感谢北京市新技术应用研究所张天佑教授在高速逆流色谱领域曾给予的细心指导，感谢丛书编委会以及责任编辑的辛勤工作。

本书的撰写得益于谌学先、艾萍、字敏、段爱红、李正宇等同事多年的合作以及课题组数十位博士及硕士研究生的研究，在此一并表示衷心的感谢。

由于水平的有限，书中错误和不足在所难免，敬请专家和读者给予批评指正。

袁黎明

运用硅胶柱色谱，Sephadex LH-20柱色谱，以及高效液相制备色谱等手段分离和纯化化合物，再通过光谱学的方法，结合化合物的理化性质鉴定它们的结构。从毛红椿茎叶的95%乙醇提取物中分离得到23个化合物，分别鉴定为4,7-二甲氧基-5-甲基香豆素、4,6,7-三甲氧基-5-甲基香豆素、异莨菪亭、莨菪亭、6,7-二甲氧基香豆素、7-羟基-6,8-二甲氧基香豆素、dehydrodiconiferyl alcohol、(-)-落叶松脂素、thero-2,3-bis-(4-hydroxy-3-methoxypheyl)-3-methoxy-propanol、环桉烯醇、8(14),15-isopimaradiene-2,3,19-triol、3S,5R-dihy-droxy-6R,7-megstigmadien-9-one、黑麦草内酯、(+)-儿茶素、苹果酸二甲酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、1,3,5-三甲氧基苯、丁香酸、丁香醛、香兰酸、香草醛、3,3′,5,5′-四叔丁基-2,2′-二羟基苯。

禾本科金发草属植物金丝草的抗乙型肝炎病毒(H BV)活性物质基础.方法:采用硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱并结合重结晶等方法进行分离纯化,根据理化性质和波谱数据鉴定单体化合物的结构.结果:从金丝草干燥全草的60%乙醇提取物中分离得到6个单体化合物,分别鉴定为木犀草素-6-C-β-D-鸡纳糖苷(1)、牡荆素鼠李糖苷(2)、异牡荆素-4'-O-α-L-鼠李糖苷(3)、金丝桃苷(4)、槲皮素-3-甲醚(5)、D-甘露醇(6).结论:所有化合物均为首次从金发草属植物中分离得到.

【摘录】《中华本草》