北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质--双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。
针对婴幼儿奶粉中基质复杂的特点，本方法加大了净化材料的用量，以获得了更好的净化效果。建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。
1实验部分
1.1仪器、试剂与材料
高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。
双氰胺标准品(CAS: 461-58-5;FW=84.08)，采用Hypercard色谱柱(3cc，200mg/PN:60106-301)和 HILIC液相色谱柱(SyncronisHILIC PN:97505-102130)，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。
表1双氰胺的信息
名称 | 结构式 | 分子量 | CAS |
双氰胺 | 84.08 | 461-58-5 |
1.2实验步骤
称取1g试样于50mL具塞离心管中，加2mL水，涡旋30s，加2ml乙腈涡旋30s。再往现有的提取液中加2mL乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次，得到共计约10mL的提取液。以4000r/min离心5min，将全部上清液加入Hypercard色谱柱(3cc，200mg/PN:60106-301)，将MAS管上下晃动30s，然后涡旋30s后，8000r/min离心5min，取全部上清液(约10ml)于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入1ml乙腈复溶，过0.22μm微孔滤膜，待测。
注:1.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀;
2.乙腈提取分4次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果。
1.3实验条件
1.3.1高效液相色谱法(HPLC法):
色谱柱:HILIC液相色谱柱(SyncronisHILIC PN:97505-102130)5μm，2.1*1500mm;
流动相: 10mmol/L乙酸铵(pH=4.0):乙腈=15: 85;
波长:220nm;进样量:10µl;柱温:25℃;流速:0.8mL/min。
1.3.2LC-MS/MS法:
(1)色谱条件:
色谱柱:HILIC液相色谱柱(SyncronisHILIC PN:97505-102130)5μm，2.1*1500mm;
流动相:A:0.5mmol/L乙酸铵(pH=4.0)
B:乙腈;
进样量:10µL;柱温:25℃;流速:0.3 mL/min。
表2流动相梯度程序
时间，min | A% | B% |
0 | 10 | 90 |
0.4 | 50 | 50 |
1.8 | 50 | 50 |
1.9 | 10 | 90 |
7 | 10 | 90 |
(2)质谱条件:
质谱仪:API 4000+;离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测;CAD:8.00;CUR:20.00;GS1:60.00;GS2:50.00;IS:5500.00;TEM:600.00。
表3双氰胺质谱信息
药物名称 | 监测离子对 | DP | EP | CE | CXP |
双氰胺 | 85.1/68.1 | 71 | 10 | 41 | 6 |
85.1/43.1 | 71 | 10 | 41 | 6 |
注:带"____"的监测离子对为定量离子对。
2.结果与讨论
2.1高效液相色谱法:
2.1.1双氰胺的液相色谱图
图1双氰胺1µg/ml标准溶液的液相色谱图
2.1.2实际样品基质加标的线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液;
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL和10µg/g的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，结果见表4:
表4双氰胺线性方程和定量限(HPLC法)
名称 | 保留时间 | 线性方程 | 相关系数 | 最低定量限(S/N=10) |
双氰胺 | 5.57min | Y=108.16X+27.827 | 0.9971 | 0.5µg/g |
2.1.3准确度和精密度
选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表5
表5 0.5µg/g添加回收实验结果(HPLC法)
平行1 | 平行2 | 平行3 | 平均值 | RSD |
82.3% | 85.5% | 89.1% | 85.63% | 3.97% |
图2 婴幼儿奶粉空白液相色谱图
图3 婴幼儿奶粉0.5µg/g添加双氰胺的液相色谱图
2.2LC-MS/MS法
2.2.1双氰胺的LC-MS/MS图
图4双氰胺10ng/ml标准溶液质谱图
2.2.2实际样品基质加标的线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液;
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6:
表6 双氰胺线性方程和定量限(LC-MS/MS法)
名称 | 保留时间 | 线性方程 | 相关系数 | 最低定量限(S/N=10) |
双氰胺 | 2.25min | Y=3859.1X+23694 | 0.9900 | 2ng/g |
2.2.3准确度和精密度
选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。
表7 10ng/g添加回收实验结果
平行1 | 平行2 | 平行3 | 平均值 | RSD |
82.5% | 83.5% | 89.3% | 85.2% | 4.31% |
图 5 婴幼儿奶粉空白质谱图
图 6 婴幼儿奶粉10ng/g添加水平的质谱图
