1. 印迹膜制备 按常规方法完成SDS-PAGE和电转膜操作，适当的封闭非常重要。可以通过标记一抗或二抗的手段引入HRP，一般采用市售的HRP二抗交联物。仔细地淋洗对于降低背景非常重要，在与HRP交联物温育后，膜片更需仔细洗涤，所有步骤均在室温下完成。

2. 化学发光试剂的配置 在使用前等量混合a液和b液，混合后尽快使用。将膜片置混合液中于室温下振荡温育2分钟，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆盖全膜片。

3.蛋白信号显现

1). 用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸以吸去过量试剂。

2). 置膜片于二层保鲜膜之间，小心赶尽气泡。

3). 将膜片吸附蛋白面朝上，置于x光片盒中。

4). 于暗室中压上x光片。

5).根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。显影冲洗。

6). 调节曝光时间，再次曝光显影。

4、膜的重复使用:

配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巯基乙醇的溶液，膜放入后，70?c振荡水浴30分钟。再用tbst或pbst缓冲液洗脱，最后用bsa(牛血清白蛋白)或牛奶封闭。