抗过氧化物复合物制备技术

Stemberger(1970)等，首先报道了过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物(peroxidase-antiperoxidase,PAP)法，此法也称为非标记抗体酶法(unlabelled antibody enzymemethod)。PAP法不需用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反应的影响，可大大提高免疫酶法的灵敏度。

(1)取5mL抗HRP血清，16 000r/min 4℃离心20min，取上清液。

(2)加入1mL HRP(2mg/mL)溶液混匀，室温(20℃±)静置1h，16 000r/min，4℃离心20min，取沉淀物。

(3)加冷生理盐水反复洗涤-离心(16 000r/min，4℃离心20min)3次，弃上清，取沉淀物。

(4)加入过量HRP溶液4mL(2mg/mL)混匀后，移至小烧杯内。

(5)在pH计监控下，边搅拌边加入0.1及0.01mol/L HCl调至pH2.4左右，使沉淀完全溶解。

(6)立即加入0.01mol/LnaOH,调pH7.4，16 000r/min，4℃离心20min，取上清液。

(7)加入1/10体积的0.075mol/L醋酸钠和0.15mol/L醋酸铵的等量混合液后混匀。

(8)电磁搅拌下逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液，并继续搅拌10min，4℃放置20min，16 000r/min，4℃离心20min，去上清，取深沉物。

(9)以50%饱和硫酸铵洗涤，4℃、16 000r/min×20min，离心2次，取深沉物。

(10)加5mL蒸馏水将深沉物溶解后装入透析袋，用Ph6.75醋酸盐缓冲液(13.5L生理盐水、1.5L蒸馏水、75mL 1.5mol/L醋酸钠及75mL粉酶3moL/L醋酸铵)4℃透析3d，每天换液2次。

(11)17 000r/min，4℃离心20min，取上清液进行工作效价鉴定。

(12)加等量60%甘油，小量分装，-20℃保存。