隧道显微镜的原理是巧妙地利用了物理学上的隧道效应及隧道电流。金属体内存在大量"自由"电子，这些"自由"电子在金属体内的能量分布集中于费米能级附近，而在金属边界上则存在一个能量比费米能级高的势垒。因此，从经典物理学来看，在金属内的"自由"电子，只有能量高于边界势垒的那些电子才有可能从金属内部逸出到外部。但根据量子力学原理，金属中的自由电子还具有波动性，这种电子波在向金属边界传播而遇到表面势垒时，会有一部分透射。也就是说，会有部分能量低于表面势垒的电子能够穿透金属表面势垒，形成金属表面上的"电子云"。这种效应称为隧道效应。所以，当两种金属靠得很近时(几纳米以下)，两种金属的电子云将互相渗透。当加上适当的电压时，即使两种金属并未真正接触，也会有电流由一种金属流向另一种金属，这种电流称为隧道电流。

隧道电流和隧道电阻随隧道间隙的变化非常敏感，隧道间隙即使只发生0.01nm的变化，也能引起隧道电流的显著变化。

如果用一根很尖的探针(如钨针)在距离该光滑样品表面上十分之几纳米的高度上平行于表面在x，y方向扫描，由于每个原子有一定大小，因而在扫描过程中隧道间隙就会随x，y的不同而不同，流过探针的隧道电流也不同。即使是百分之几纳米的高度变化也能在隧道电流上反映出来。利用一台与扫描探针同步的记录仪，将隧道电流的变化记录下来，即可得到分辨本领为百分之几纳米的扫描隧道电子显微镜图像。