疏水作用吸附需要使用疏水作用的吸附剂，它与其他吸附技术所用的吸附剂相类似，由作为骨架的基质和键合在基质上参与疏水作用的配基组成。

①基质可分为“软基质”，其中以琼脂糖使用最广泛，另外还有葡聚糖、高分子聚合物和纤维素等；“硬基质”主要是大孔径硅胶。琼脂糖一类凝胶的优点是亲水性强，表面羟基密度非常大，衍生化后可产生取代程度和结合容量较大的吸附剂，其大孔结构适合于大分子蛋白质的分离，且pH值稳定性良好。硅胶的特点是硬度大，机械稳定性高，但其表面可供衍生的基团少，且仅在pH值2～8范围内稳定，因此其应用受到限制。但后来采用了聚合物包裹技术，在硅胶或其他有机聚合物表面包裹一层带有可衍生基团的高分子材料，从而克服了上述缺点，使其具备良好的分离性能，得到了广泛的使用。

②疏水性配基主要有苯基、短链烷基(C₃～C₈)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。疏水性配基与亲水性基质之间的偶联主要利用氨基的结合或醚键结合来实现。疏水吸附剂作用与其他吸附剂不同，它们对组分的分离要比在相同情况下的离子交换色谱要好。其优点是对蛋白质的吸附容量较大(10～100mg/cm)，并可重复使用，效果不变，但其使用有局限性，所能达到的分辨率也不高。