离子交换色谱的流动相通常是含盐的缓冲水溶液。为了适应不同的分离需要，有时添加适量的能与水相溶的有机溶剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等，以改进样品的溶解性能，提高选择性，改善分离。
在以水溶液为流动相的离子色谱中，缓冲溶液的浓度直接影响着离子平衡。当缓冲液浓度增加时，流动相中反离子浓度的增加，增强了它与样品离子争夺离子交换官能团的能力，从而减弱样品组分与离子交换树脂的亲和性。流动相中的离子类型对样品分子的保留值产生显著的影响。流动相中不同的离子与离子交换树脂相互作用的能力不同。
在离子交换色谱中，还可以通过改变流动相的pH值来控制样品分子的保留值。pH值能影响样品分子的解离程度，从而影响它们与离子交换剂相互作用的强弱。在阳离子交换色谱中增加pH值，溶质分子的解离减少，降低了它们与离子交换剂上阳离子的竞争能力，从而降低了保留值 。
