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双向电泳操作步骤

双向电泳操作步骤

第一向等电聚焦

⒈ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含IPG buffer)一小管(1ml/管),置室温溶解。

⒉ 在小管中加入0.01g DTT, 0.5% 对应胶条pH范围的IPG buffer,充分混匀。

⒊ 从小管中取出400微升水化上样缓冲液,加入100微升样品(考马斯亮蓝染色需样品1mg,银染需300μg),充分混匀。

⒋ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条,室温中放置10分钟。

⒌ 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。

⒍ 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

⒎ 分清胶条的正负极,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。

⒏ 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

⒐ 对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序。

⒑聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20℃冰箱保存。

第二向SDS-PAGE电泳

⒈ 装配灌胶模具,配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配200ml凝胶溶液,每块凝胶50ml,将溶液沿灌胶模具背面槽道倒入,直至溶液到距离玻璃板1cm停止,用75%乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整。聚合30分钟后,凝胶与上方液体分层,表明凝胶已基本聚合,建议聚合3-5h使凝胶完全聚合。

⒉ 待凝胶凝固后,倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ水冲洗。

⒊ 从-20℃冰箱中取出的胶条,先于室温放置10分钟,使其恢复至室温。

⒋ 配制胶条平衡缓冲液I(含DTT)。

5.在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

⒍ 将胶条转移至平衡管或溶胀盘中,每个槽一根胶条,在有胶条的槽中加入5-10ml胶条平衡缓冲液I。将平衡管或溶胀盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

⒎ 配制胶条平衡缓冲液Ⅱ(含碘乙酰胺)。

⒏ 第一次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ,继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

⒐ 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶部对着自己。

⒑将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解。

⒒将10×电泳缓冲液,用量筒稀释10倍,成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。

⒓第二次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液Ⅱ。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。

⒔将IPG胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。

⒕将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

⒖用镊子、压舌板或是平头的针头,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面。

⒗放置5分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。

⒘在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。

⒙在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时用的低功率(1W/gel/18-24cm)或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,再加大电流(或电压)(13-15W/gel/18-24cm),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

⒚电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防止污染胶面)。

⒛进行染色。

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双向电泳造价信息

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双向电泳常见问题

重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽,直接跑 2D 的一向吗?

一般情况下是可以的。但当上样量特别大时,可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收,这样跑完 1D 和 2D 胶后,会有很多横向条纹。所以在这种情况下,最好在重泡胀后,将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。

为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少,暴露出了胶条的背面?

通常情况下,等点聚焦中体系内除了蛋白质还会存在少量带电小分子,当这些带电小分子在电场中向两极运动时,会带动胶条中的水分子运动,水分子运动会带动附近的覆盖油移动,当样品质量不高,带电小分子较多时,会导致覆盖油移动严重溢出胶条槽,此时,通常会伴随胶条的酸性端胶条厚度增加。当发生覆盖油溢出或胶条暴露时,应及时补加覆盖油。为了防止这个现象的发生,应从样品制备时严格控制样品质量,尽量减少带电小分子如盐离子的含量。同时可以在相邻的空电泳槽里,也加入适量(80 %满)的覆盖油。

跑第一向时,为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)?

电流的平方和功率成正比。电流增大,功率增大,放出的热量也随之增大,就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时,缓冲液里的尿素就容易解离,产生一些极性分子,修饰蛋白,从而对等电聚焦产生影响。

跑第一向时,为什么刚开始的电压比较低,而后逐渐增高?

刚开始时,体系内的带电小分子比较多(比如无机盐和双极性分子)。所以在这个阶段,电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小,移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时(无机盐移动到极性相反的电极;两性分子移动到对应的 pH 条带),体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务,逐渐向所对应的 pH 区域移动,而蛋白质运动需要较高的电压。

跑第一向时,为什么会产生一条蓝色的条带,并逐渐向酸性端移动?

蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂,当它移动到酸性区时(pH4),颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后,蛋白质大分子聚焦之前。

跑第一向时,为什么电压总达不到预定值?

当上样量比较大时或体系内盐分比较多时,聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。

跑第一向时,在电压达到预定值后,电流为什么会降低?

当上样量比较少时,所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值,从而变成中性分子。这样,体系的电阻越来越大,在恒定的电压下,电流就会越来越小。

跑第一向时,为什么在两个电极丝附近有气泡产生?

等电聚焦完成后,所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域,而成为中性分子。这时加在体系上的电压就开始电解水分子,在阳极产生氧气,在阴极产生氢气。

重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么,双极性分子的作用是什么?

硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性,特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后,就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集,从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率,可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用,防止它们的聚集。

怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值?

可以根据胶条的pH范围和长度估算蛋白质点的pI值,在第二向中加入分子量Marker估算蛋白质点分子量。也可以用体系内已知蛋白来做比对。

为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾?

横的脱尾可能是:1)一向等电聚焦不完全; 2)某些蛋白质本身的原因(糖蛋白); 3)蛋白的丰度太高。竖的脱尾可能是1)平衡时碘乙酰胺量不足;2)跑二向时,蛋白的溶解度不好。

什么成分会影响 2D 胶的效果?

核酸,盐,去垢剂等等。

2D 胶的上样量应该在什么范围?

上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些,这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系,上样量大概在 100 微克(银染)到 500 微克(考染)之间。

我的蛋白质浓度很低,应该用什么方法来浓缩?

蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法,沉淀法和透析法。超滤比较温和,对蛋白质不会有修饰和改变,蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少(被膜所吸附)。另外超滤对样品的要求比较高。甘油,去垢剂都会堵塞滤膜,影响超滤的效果。沉淀法比较快速,容易操作,对盐,甘油,去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来(丢失)。沉淀法中,又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时,一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次,去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品,量小时,操作困难。透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境(不含盐,甘油,去垢剂或其它杂质,比如碳酸氢氨溶液),然后再进行超滤。

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双向电泳斑点检测

分离后的斑点检测(spot detection)亦很重要. 所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外,还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前,没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术.银染已成为一种检测2-DE的流行方法,可检测少到2~5ng的蛋白,因此较考马斯亮蓝R-250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色,一些有机染料不适于PVDF膜.放射性标记不依赖其代谢的活性,并仅适于对合成的蛋白质检测. 另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳),即应用两种不同的染料荧光标记两个样品,使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个,避免了几种2-DE的比较,可在纳克级进行检测.

较早期相比,2-DE有两个主要的进步:首先,极高的重复性使有机体的参考图谱,可通过Internet获得,来比较不同组织类型、不同状态的基因表达;其次,高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术.

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双向电泳操作步骤常见问题

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双向电泳研究方向

目前,随着技术的飞速发展,已能分离出10 000个斑点(spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候,蛋白质组的分析变得可行.

样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效,目标是尽可能扩大其溶解度和解聚,以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白,两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物质. 理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换.三丁基膦(Tributyl phosphine,TBP)取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键,增强了蛋白的溶解度,并导致转至第二向的增加]. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度,作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下,可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA). 除此之外,机械力被用来对蛋白分子解聚,如超声破碎]等. 另外,添加PMSF等蛋白酶抑制剂,可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的,可在其水化的过程中加样,覆盖整个IPG胶,避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失]. 此外,低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能,代表蛋白质组研究的"冰山之尖",故分离低丰度蛋白是一种挑战.亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1~15 mg级的标准)、应用敏感性检测,可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点. 由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生,对PI(等电点)超过10的碱性蛋白,通过产生?0~10%?的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之. 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.

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双向电泳送样要求

1、 样品新鲜。

说明:组织样本及细胞采样后应立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂,运输过程中血液、血清样品4℃保存,其它样品-20℃保存,不超过48小时(若外地邮寄,除血液、血清及细胞外请用干冰)。

2、 样品蛋白的总量不少于1mg。

说明:组织样本每份约250-500mg;

细胞样品每份106-107细胞数(一块胶);

血液、血清等样品大于5mL,且不能溶血;

蛋白提取物要求蛋白浓度大于5mg/mL,总量不少于1mg,且均匀无沉淀,样品中无盐成分;

植物或真菌样品量湿重不少于2g;

富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于3g 。

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双向电泳操作步骤文献

全站仪操作步骤 全站仪操作步骤

全站仪操作步骤

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页数: 3页

全站仪操作步骤 1.架好仪器,对中整平。 2.开机→按 MENU键→F3(存储管理)→ F4(翻页)→ F1(输 入坐标)→ F1(输入)输入一个文件名,如: File ,回车后 输入点名如 A,回车后输入坐标( N,E,Z),输入完后回车 输入第二个点名如 B,回车后输入坐标( N,E,Z),回车后 进入输第三个点界面,这时按两次 ESC退出到“数据采集” 界面。 3.按 F1(数据采集)→ F1(输入)输入刚才的文件名 File , →F1(输入测站点)→ F4(测站)→ F2(调用)找到 A,回 车,检查屏幕显示的坐标是否正确,是则按 F3(是)→输入 仪高(如 1.5 米),按 F3(记录)→ F3(是)。这时返回到 了数据采集界面。 4.全站仪照准后视点, 按 F2(输入后视点) →F4(后视)→F2 (调用) 找到 B点,F4(回车) →F3(是)→F3(测量)→ F1 (角度

广联达操作步骤 广联达操作步骤

广联达操作步骤

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页数: 5页

广联达操作步骤: 新建工程——新建楼层——新建轴网——绘图输 入——汇总查量 新建工程: 1、 第一步工程名称 注意计算规则一定要选择正确, 其他根据不同省份修改,福建省选择不计算损耗 和全统 2000 2、 第二步工程信息 黑色字体只起到标示作用, 只需 要修改蓝色字体的信息,详细看图纸。 3、 第四步比重设置 当图纸中所有的直径为 6的钢 筋都为一级钢筋时要把的比重复制到 6的比重 内。 新建楼层: 1、 插入楼层:鼠标点击到基础层或者地下层的时候 再点击插入楼层是新建地下楼层,鼠标点击到首 层或者其他地上楼层时是新建地上楼层。 2、 只有楼层名称、层高、首层底标高等白色底纹的 能进行修改。 3、 楼层钢筋设置主要修改抗震等级(一个工程出现 多个抗震等级时)、混凝土标号、保护层厚度。 新建轴网: 1、一般都是以柱平面图的轴网为准。 2、操作步骤:新建轴网—定义属性 (上下开间或左右

Bio-Rad双向电泳装置概述

Bio-Rad双向电泳装置

特点:可同时运行四块凝胶,多种胶长度选择,内置冷却芯,不同孔数和梳子选择。

用途:适用于一系列电泳,如SDS-PAGE,双向电泳的一向和二向,Native电泳,制备电泳,梯度电泳及高分辨率的核酸琼脂糖电泳等。

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北京市六一仪器厂产品分类

电泳仪电源系列、电泳仪系列、紫外仪系列、显微细胞电泳系统、凝胶成像分析系统、酶标仪和自动洗板机、脉冲电泳系统、基因扩增仪、超声波清洗器、其他产品、配件、配套及代理产品、试剂、种子检测系统、双向电泳系统、基层医疗产品系列2100433B

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双向凝胶电泳操作步骤

样品要求

1、建议使用的蛋白质溶解体系为8M尿素/4%CHAPS /40mMTris(Base)/65mM DTT;

2、样品浓度大于2 μg/ μl;

样品制备

双向电泳成功的关键在于建立一套有效的、可重复的样品制备方法。样品制备的影响因素包括蛋白质的溶解性、分子量、电荷数及等电点等。对于不同的样品性质及研究目的,其方法也不尽相同。不同的样品性质, 用于样品处理的缓冲液必须在低离子强度的基础上,既能保持蛋白质的天然电荷。又能维持其溶解性。因此,绝大多数样品往往都需要通过多次实验才能摸索到最适宜的条件。

第一向分离

等电聚焦

蛋白质是两性分子,在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质来说都有一个特定的pH,此时蛋白质的静电荷为零,此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时,它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中,蛋白分子可能获得或失去质子,并且随着移动的进行,该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移至其等电点pH位置时,其净电荷数为零,在电场中不再移动。聚焦是一个与pH相关的平衡过程:蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值;在等电聚焦过程中,蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。

第二向分离

SDS.聚丙烯酰胺凝胶电泳

双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS.PAGE凝胶上,根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。

蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质.SDS复合物,由于SDS是一种强阴离子去垢剂.所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量,能消除不同分子之间原有的电荷差异,从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响.而主要取决于蛋白质分子的质量大小,其迁移率与分子量的对数呈线性关系,在蛋白质组研究中。需要在同样的条件下同时走多块胶,这对凝胶与凝胶之间的比较十分重要。

修饰和加工

蛋白质的翻译后修饰和加工,是指在肽链合成完成后进行的化学反应,如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成,以及目前发现的蛋白质自剪接等等,可能有一百种以上。翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的,它们的变化往往和疾病的发生有关。用双向凝胶电泳可以进行翻译后修饰的研究,如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化。双向凝胶电泳中常可发现的蛋白质拖曳现象,很可能是一个蛋白的不同翻译后修饰产物所造成的。拖曳图像变化在疾病诊断上可能提供重要的信息。

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