第一向等电聚焦

⒈ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT，不含IPG buffer)一小管(1ml/管)，置室温溶解。

⒉ 在小管中加入0.01g DTT， 0.5% 对应胶条pH范围的IPG buffer，充分混匀。

⒊ 从小管中取出400微升水化上样缓冲液，加入100微升样品(考马斯亮蓝染色需样品1mg，银染需300μg)，充分混匀。

⒋ 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟。

⒌ 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。

⒍ 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

⒎ 分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。

⒏ 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

⒐ 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。

⒑聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。

第二向SDS-PAGE电泳

⒈ 装配灌胶模具，配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配200ml凝胶溶液，每块凝胶50ml，将溶液沿灌胶模具背面槽道倒入，直至溶液到距离玻璃板1cm停止，用75%乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟后，凝胶与上方液体分层，表明凝胶已基本聚合，建议聚合3-5h使凝胶完全聚合。

⒉ 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。

⒊ 从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其恢复至室温。

⒋ 配制胶条平衡缓冲液I(含DTT)。

5.在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

⒍ 将胶条转移至平衡管或溶胀盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5-10ml胶条平衡缓冲液I。将平衡管或溶胀盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

⒎ 配制胶条平衡缓冲液Ⅱ(含碘乙酰胺)。

⒏ 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

⒐ 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。

⒑将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解。

⒒将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。

⒓第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液Ⅱ。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。

⒔将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。

⒕将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

⒖用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。

⒗放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。

⒘在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。

⒙在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低功率(1W/gel/18-24cm)或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流(或电压)(13-15W/gel/18-24cm)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

⒚电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号(戴手套，防止污染胶面)。

⒛进行染色。

重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗?

一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。

为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面?

通常情况下，等点聚焦中体系内除了蛋白质还会存在少量带电小分子，当这些带电小分子在电场中向两极运动时，会带动胶条中的水分子运动，水分子运动会带动附近的覆盖油移动，当样品质量不高，带电小分子较多时，会导致覆盖油移动严重溢出胶条槽，此时，通常会伴随胶条的酸性端胶条厚度增加。当发生覆盖油溢出或胶条暴露时，应及时补加覆盖油。为了防止这个现象的发生，应从样品制备时严格控制样品质量，尽量减少带电小分子如盐离子的含量。同时可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量(80 %满)的覆盖油。

跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)?

电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，修饰蛋白，从而对等电聚焦产生影响。

跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高?

刚开始时，体系内的带电小分子比较多(比如无机盐和双极性分子)。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时(无机盐移动到极性相反的电极;两性分子移动到对应的 pH 条带)，体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动，而蛋白质运动需要较高的电压。

跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动?

蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时(pH4)，颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。

跑第一向时，为什么电压总达不到预定值?

当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。

跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低?

当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。

跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生?

等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中性分子。这时加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。

重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么?

硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。

怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值?

可以根据胶条的pH范围和长度估算蛋白质点的pI值，在第二向中加入分子量Marker估算蛋白质点分子量。也可以用体系内已知蛋白来做比对。

为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾?

横的脱尾可能是:1)一向等电聚焦不完全; 2)某些蛋白质本身的原因(糖蛋白); 3)蛋白的丰度太高。竖的脱尾可能是1)平衡时碘乙酰胺量不足;2)跑二向时，蛋白的溶解度不好。

什么成分会影响 2D 胶的效果?

核酸，盐，去垢剂等等。

2D 胶的上样量应该在什么范围?

上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在 100 微克(银染)到 500 微克(考染)之间。

我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩?

蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少(被膜所吸附)。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来(丢失)。沉淀法中，又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境(不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液)，然后再进行超滤。

分离后的斑点检测(spot detection)亦很重要. 所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前，没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术.银染已成为一种检测2-DE的流行方法，可检测少到2~5ng的蛋白，因此较考马斯亮蓝R-250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色，一些有机染料不适于PVDF膜.放射性标记不依赖其代谢的活性，并仅适于对合成的蛋白质检测. 另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳)，即应用两种不同的染料荧光标记两个样品，使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个，避免了几种2-DE的比较，可在纳克级进行检测.

较早期相比，2-DE有两个主要的进步:首先，极高的重复性使有机体的参考图谱，可通过Internet获得，来比较不同组织类型、不同状态的基因表达;其次，高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术.

目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点(spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行.

样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质. 理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换.三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP)取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加]. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA). 除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎]等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失]. 此外，低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的"冰山之尖"，故分离低丰度蛋白是一种挑战.亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1~15 mg级的标准)、应用敏感性检测，可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点. 由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生，对PI(等电点)超过10的碱性蛋白，通过产生?0~10%?的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之. 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.

1、 样品新鲜。

说明:组织样本及细胞采样后应立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂，运输过程中血液、血清样品4℃保存，其它样品-20℃保存，不超过48小时(若外地邮寄，除血液、血清及细胞外请用干冰)。

2、 样品蛋白的总量不少于1mg。

说明:组织样本每份约250-500mg;

细胞样品每份106-107细胞数(一块胶);

血液、血清等样品大于5mL，且不能溶血;

蛋白提取物要求蛋白浓度大于5mg/mL，总量不少于1mg，且均匀无沉淀，样品中无盐成分;

植物或真菌样品量湿重不少于2g;

富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于3g 。

1、建议使用的蛋白质溶解体系为8M尿素/4%CHAPS /40mMTris(Base)/65mM DTT;

2、样品浓度大于2 μg/ μl;

双向电泳成功的关键在于建立一套有效的、可重复的样品制备方法。样品制备的影响因素包括蛋白质的溶解性、分子量、电荷数及等电点等。对于不同的样品性质及研究目的，其方法也不尽相同。不同的样品性质， 用于样品处理的缓冲液必须在低离子强度的基础上，既能保持蛋白质的天然电荷。又能维持其溶解性。因此，绝大多数样品往往都需要通过多次实验才能摸索到最适宜的条件。

等电聚焦

蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。聚焦是一个与pH相关的平衡过程:蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值;在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。

SDS.聚丙烯酰胺凝胶电泳

双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS.PAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。

蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质.SDS复合物，由于SDS是一种强阴离子去垢剂.所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响.而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系，在蛋白质组研究中。需要在同样的条件下同时走多块胶，这对凝胶与凝胶之间的比较十分重要。

蛋白质的翻译后修饰和加工，是指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成，以及目前发现的蛋白质自剪接等等，可能有一百种以上。翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。用双向凝胶电泳可以进行翻译后修饰的研究，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化。双向凝胶电泳中常可发现的蛋白质拖曳现象，很可能是一个蛋白的不同翻译后修饰产物所造成的。拖曳图像变化在疾病诊断上可能提供重要的信息。