第一篇沼气发酵工艺参数的测定

实验1沼气发酵原料和料液的总固体（TS）含量测定2

实验2原料和料液的挥发性固体（VS）含量和灰分测定5

实验3溶解氧（DO）测定——碘量法7

实验4CODCr测定11

实验5BOD5的测定15

实验6总有机碳（TOC）的测定21

实验7氨态氮（NH 4N）的测定26

实验8总氮（N）素的测定30

实验9磷和总磷的测定36

实验10钙（Ca2 ）的测定——EDTA滴定法46

实验11钾（K ）的测定——四苯硼钠法53

实验12铁（Fe）的测定——邻菲啰啉比色法61

实验13氧化还原电位测定法68

实验14沼气发酵原料和料液的pH值测定73

实验15产CH4菌的MPN法计数77

实验16燃烧热测定81

参考文献87

第二篇沼气发酵中基础物质及相关活性生物物酶测定

实验17还原糖与总糖的分析测定94

实验18淀粉分解酶的测定分析104

实验19蔗糖酶的测定分析111

实验20半纤维素的分离提取与分析测定114

实验21半纤维素酶（木聚糖酶）的分析测定127

实验22纤维素的分析测定139

实验23纤维素降解酶的分析测定145

实验24木质素的分离提取与分析测定153

实验25木质素降解酶的分析测定165

实验26脱氢酶的分析测定186

实验27蛋白质与蛋白酶的分析测定193

实验28沼气发酵中气体成分测定方法202

参考文献204第三篇沼气发酵实验

实验29农作物秸秆及畜禽粪便批量发酵实验214

实验30农作物秸秆及畜禽粪便连续发酵实验217

实验31厌氧污泥的产甲烷活性测定221

实验32厌氧生物可降解性测定226

实验33产甲烷毒性的测定230

实验34反应器内污泥量的测定237

实验35生物化学甲烷势的测定239

实验36UASB反应器处理有机废水实验240

参考文献244

1.该书是全国农业工程方面、生物质沼气利用方面的首部沼气发酵实验教程.

2.内容包括沼气发酵中的各种实验，对研究生、本科生及生物质能等利用开发人员有较好的参考作用。

虽然早在1630年比利时布鲁塞尔的医生Van Helment就已经认识到了沼气，但对沼气发酵的科学认识却始于1901年。百年来，沼气的发展十分迅速，沼气微生物的研究从技术方法、群体代谢、个体水平到分子生物学、基因研究、Methanococcus jannaschii全基因组序列的测定，沼气发酵从工艺过程到设备配套技术，沼气技术的应用从废弃物能源利用到环境和生态的可持续发展等方面均取得了长足的发展。

在产甲烷菌的研究方面，个体产甲烷菌的分类地位逐渐提高，短短几十年，产甲烷菌由一个科上升至5目、10科、26属；对产甲烷菌细胞壁结构、膜质成分、16S rRNA亲缘关系、7种辅酶因子形成甲烷的机制等的揭示，改变了种系发生的传统二分法理论，提出了生命三领域学说(Three Domains Theory)：古核生物(arachaea)、细菌(bacteria)和真核生物(eucarya)。在沼气发酵的工艺方面，从简单的沼气发生器出现后，先后又提出和发展了一系列工艺技术，如高速消化器、厌氧接触消化器、UASB、AF、两相厌氧消化器、厌氧流化床和厌氧膨胀床等，这些技术的开发和应用拓宽了厌氧消化技术的服务范围，大大提高了厌氧消化的效率。从能源的开发与利用来看，沼气技术利用有机废弃物生产能源，即在有效治理有机污染的同时开发清洁能源；这种能源开发利用方式能够保持大气中二氧化碳的循环，或二氧化碳零排放。

沼气发酵系统涉及内容广泛，理论、应用与实践共同发展，多学科交叉与渗透十分突出，沼气的推广应用涉及多部门间的合作与协调。既有基础微生物学、分子生物学研究，又有发酵工程的内容；既有工艺学的研究，又有工程的建筑与设计；既有微生物代谢与代谢产物的研究，又有沼气发酵残留物的各种综合利用；既有废物的处理与能源利用，又有环境与生态工程的实践；既有以沼气为纽带的可持续农业理论探索，又有各种生态农业模式的涌现；既有农村家用沼气池的应用，又有大中型沼气工程的运行；既有禽畜场大中型沼气工程、工厂有机废水处理沼气工程，又有城镇生活污水沼气净化工程。

沼气发酵是生物质能源转化的有效形式之一，特别是对于解决农村能源以及治理有机废物和废水环境污染等问题具有重要的作用。我国农村沼气30多年来的实践表明，沼气在解决我国农村能源方面发挥着积极的甚至是不可替代的作用；以沼气为纽带的生态农业建设，取得了长足的发展，南方“猪沼果”、北方“四位一体”、西北“五配套”生态模式有力地促进了农村经济的可持续发展；“三结合”、“一池三改”的农村沼气建设，改善了农村环境卫生，整治了村容村貌，有效地促进了新农村的建设。我国农村沼气建设成功的经验已被世界所认识，在发达国家资金的扶持下，发展中国家农村沼气建设正在蓬勃发展，2008年荷兰政府启动了非洲沼气行动计划，荷兰政府在全球筹资20亿欧元，将用十年的时间在非洲建设200万个农村家用沼气池；亚洲银行出资，其中2/3是补助资金，1/3是贷款，支持亚洲发展150万个农村家用沼气池。

20世纪80年代以来厌氧消化技术应用于有机废水的处理，各种厌氧消化工艺趋于成熟和高效，在污水处理方面发挥着越来越重要的作用。面对养殖场大量的粪便废水，最有效的处理方法就是厌氧消化，这种处理方式实现了粪便废水的资源化利用，在环境污染的治理中获得较好的经济收益。以沼气工程为纽带，将污染治理转化为资源开发的优势，用环保治理拉动企业的可持续发展，使环保产业作为产业建立的基础，建立饲料(feed)、肥料(fertilizer)、食品(food)和能源/燃料(fuel)的4F循环经济模式，最终获得能源、社会、生态/环境和经济四大效益，实现区域的可持续发展。

截至2011年底，全国户用沼气达到3996万户，占乡村总户数的23%，受益人口达15亿多人；中央支持建成了24万处小型沼气工程和3690多处大中型沼气工程，多元化发展的新格局初步形成；全国乡村服务网点达到9万个、县级服务站800多个，服务沼气用户3000万户左右，覆盖率达到75%，以沼气设计、沼气施工、沼气服务、沼气装备和“三沼”综合利用为主要内容的产业化体系初步建立。农村沼气从小工程做成了大产业，把小环境变成了大生态，由小项目形成了大事业。通过发展农村沼气，有效防止和减轻了畜禽粪便排放和化肥农药过量施用造成的面源污染，对实现农业节本增效、循环发展，提高农业综合生产能力和竞争力发挥了重要作用；增强了应对气候变化和保障能源安全的能力，对减少化石能源消耗、改善农村用能结构和应对气候变化发挥了不可替代的作用；实现了粪便、秸秆、有机垃圾等农村主要废弃物的无害化处理、资源化利用，使困扰新农村建设的诸多“脏乱差”环境问题得到了有效解决，提高了农民生活质量，改善了农业农村生产生态环境，成为了新时期重要的农村民生工程和新农村建设的一大亮点。

目前，许多大专院校的农业工程专业，均开设了沼气技术相关的课程，而沼气技术本身是一门实验与实践较强的专业课，从课程建设来看，国内没有一本关于沼气实验方面的教材，我们将多年硕士研究生的教学实验进行整理，并参考相关书籍编写了《沼气发酵实验教程》。该书具有较强的专业特色，主要是针对硕士研究生专业学习与完成研究论文而编写，同时兼顾相关生物质能专业的本科生学习与基本技能训练，对相关专业的博士研究生也具有资料丰富性、内容新颖性和思考题启发性的参考价值。应用该书的人员除具备一定的化学基础外，还需具备一定的生物化学与微生物学基础知识。每个实验是一个相对独立的整体，思考题则多以具体研究设计形式出现，要求理论与实际相结合，用提示的方式给出现阶段技术可行的参考方法与思考。该书不仅是硕士研究生与本科生教学的参考用书，对于高等院校科研院所的科技人员与博士研究生也有参考价值和一定的指导意义。可供从事生物质能和环境治理以及农、林、牧行业的相关研究与开发人员借鉴。

虽然《沼气发酵实验教程》是根据多年的教学经验总结而成，并参考了大量的文献资料，但终因水平有限，疏漏之处一定不少，恳请读者批评指正。

张无敌于云南师范大学

2013年8月2100433B

沼气发酵是一个复杂的生物化学过程，具有以下特点 ：

（1）参与发酵反应的微生物种类繁多，没有应用单一菌种生产沼气的先例，在生产和试验过程中需要用接种物来发酵。

（2）用于发酵的原料复杂，来源广泛，各种单一的有机质或混合物均可作为发酵原料，最终产物都是沼气。此外，通过沼气发酵能够处理COD质量浓度超过50000mg/L的有机废水和固体含量较高的有机废弃物。

（3）沼气微生物自身能耗低，在相同的条件下，厌氧消化所需能量仅占好氧分解的1/30~1/20。

（4）沼气发酵装置种类多，从构造到材质均有不同，但各种装置只要设计合理均可生产沼气。

（5）产甲烷菌要求在氧化还原电位-330mV以下的环境生活，沼气发酵要求在严格的厌氧环境中进行。

沼气发酵是指各种固态的有机废物经过沼气微生物发酵产生沼气的过程。一般可大致分为三个阶段 ：

沼气发酵液化阶段

由于各种固体有机物通常不能进入微生物体内被微生物利用，因此必须在好氧和厌氧微生物分泌的胞外酶、表面酶（纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶）的作用下，将固体有机质水解成相对分子质量较小的可溶性单糖、氨基酸、甘油、脂肪酸。这些相对分子质量较小的可溶性物质就可以进入微生物细胞之内被进一步分解利用。

沼气发酵产酸阶段

各种可溶性物质（单糖、氨基酸、脂肪酸），在纤维素细菌、蛋白质细菌、脂肪细菌、果胶细菌胞内酶作用下继续分解转化成低分子物质，如丁酸、丙酸、乙酸以及醇、酮、醛等简单有机物质；同时也有部分氢、二氧化碳和氨等无机物的释放。但在这个阶段中，主要的产物是乙酸，约占70%以上，所以称为产酸阶段。参加这一阶段的细菌称为产酸菌。

沼气发酵产甲烷阶段

由产甲烷菌将第二阶段分解出的乙酸等简单有机物分解成甲烷和二氧化碳，其中二氧化碳在氢气的作用下还原成甲烷。这一阶段称为产气阶段，或称为产甲烷阶段。

一般认为，从各种复杂有机物的分解开始到最后生成沼气，共有五大生理类群的细菌参与，它们是发酵性细菌、产氢产乙酸菌、耗氢产乙酸菌、食氢产甲烷菌和食乙酸产甲烷菌。五群菌构成一条食物链，根据其代谢产物的不同，前三群细菌共同完成水解酸化过程，后两群细菌完成产甲烷过程。

沼气发酵发酵性细菌

可用于沼气发酵的有机物种类繁多，如禽畜粪便、作物秸秆、食物及酒精加工废物等，其主要化学成分包括多糖类（如纤维素、半纤维素、淀粉、果胶质等）、脂类和蛋白质。这些复杂有机物大多不溶于水，必须首先被发酵性细菌所分泌的胞外酶分解为可溶性的糖、氨基酸和脂肪酸后，才能被微生物吸收利用。发酵性细菌将上述可溶性物质吸收进入细胞后，经发酵作用将其转化为乙酸、丙酸、丁酸和醇类，同时产生一定量的氢气及二氧化碳。沼气发酵时发酵液中乙酸、丙酸、丁酸的总量称为总挥发酸（TVA）。在发酵正常的情况下，总发挥酸中以乙酸为主。蛋白类物质分解时，除生成产物外，还会有氨额硫化氢产生。参与水解发酵过程的发酵性细菌种类繁多，已知的就有几百种，包括梭状芽孢杆菌、拟杆菌、丁酸菌、乳酸菌、双歧杆菌和螺旋菌等。这些细菌多数为厌氧菌，也有兼性厌氧菌。

沼气发酵产甲烷菌

在沼气发酵过程中，甲烷的形成是由一群高度专业化的细菌—产甲烷菌引起的。产甲烷菌包括食氢产甲烷菌和食乙酸产甲烷菌，它们是厌氧消化过程食物链中的最后一组成员，尽管它们具有各种各样的形态，但它们在食物链中的地位使它们具有共同的生理特性。它们在厌氧条件下将前三群细菌代谢的终产物，在没有外源受氢体的情况下，把乙酸转化为气体产物甲烷和二氧化碳，使有机物在厌氧条件下的分解作用得以顺利完成。 2100433B