取新鲜肾皮质组织切成2mm×2mm×4mm小块。

方法有:①化学性膜处理法,将组织块浸入0.02%~0.1%的皂角苷15~30min,皂角苷能溶解脂类物质,可引起细胞膜破坏,使细胞内可溶性蛋白流出。另外,由于皂角苷也溶解细胞内的膜性结构,因而此法仅适用于观察不含脂质的细胞骨架等结构。②物理性膜处理法,将注射器针头等锐器贴到玻璃片上,对组织进行研磨,破坏细胞膜,使细胞内可溶性蛋白流出。本法不破坏细胞内结构,适用于观察细胞内膜性结构。

低浓度戊二醛(0.125%~0.25%)短时间(15~30min)轻微固定以更好地保存超微结构(此步亦可省略),然后以10%甲醇冲洗30s,防止冷冻时冰晶形成。

用甘油将标本贴敷于标本托上,迅速置入异戊烷-丙烷混合液(-193℃)中冷冻。异戊烷-丙烷混合液的配制方法是,先将液氮盛于一较大容器中,然后将盛有异戊烷的玻璃杯放入液氮中冷却,再将丙烷吹入异戊烷中,丙烷液化而形成异戊烷-丙烷混合液。冷冻后迅速将标本移入液氮中,并用冷却后的手术刀割断组织。

将标本置入冷冻蚀刻装置中,在真空度-13300000~-133000000KPa、-95℃条件下蚀刻15~20min,使组织表层(10~20μm)的冰充分升华,显露出埋在冰中的微细构造。组织细胞含大量水分,在冷冻过程中形成均匀一致的冰(玻璃化状态),组织细胞的微细构造为这些冰所掩埋。在真空条件下,温度上升可除去冰,这一过程即蚀刻。蚀刻速度因温度而不同,-90℃为14nm/s,-110℃为0.02nm/s。以上述条件,蚀刻深度约10μm。蚀刻后的组织表面以37°角旋转喷镀白金,制取复型膜,再以90°角喷镀碳加固复型膜。

从冷冻蚀刻装置中取出标本,迅速在其表面涂以醋酸戊酯稀释的2%火棉胶,防止复型膜破裂。室温下充分干燥后将标本浮于家庭用漂白剂(次亚氯酸钠)中约1h,溶解掉复型膜以外的其它组织。然后将复型膜移至蒸馏水中,冲洗数次后载到铜网上。室温下干燥后浸入醋酸戊酯或丙酮中除去火棉胶。

自然干燥后透射电镜观察。