双螺旋进一步扭曲形成的更高层次的空间结构，包括DNA扭曲、超螺旋、多重螺旋和连环等。DNA正常的双螺旋结构处于能量最低状态，双螺旋中没有张力而处于松弛状态。如果这种正常双螺旋额外增加或减少螺旋圈数，就会使双螺旋内的原子偏离正常的位置而产生张力，这样正常的双螺旋就发生扭曲而形成超螺旋。超螺旋总是向着抵消初级螺旋改变的方向发展。超螺旋是DNA三级结构的主要形式。自从1965年Vinograd等人发现多瘤病毒的环形DNA的超螺旋以来，现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环(covalentlyclosedcircle,CCC)分子，这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋结构(superhelix或supercoil)，如下图所示。有些单链环形染色体(如φ×174)或双链线形染色体(如噬菌体入)，在其生活周期的某一阶段，也必将其染色体变为超螺旋形式。对于真核生物来说，虽然其染色体多为线形分子但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间的DNA形成一个突环(loop)结构，类似于CCC分子，同样具有超螺旋形式。超螺旋按其方向分为正超螺旋和负超螺旋两种。真核生物中，DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时，存在着负超螺旋。研究发现，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。