（1）制备两种试验材料的mRNA并反转录成cDNA，分别作为检测cDNA和驱赶cDNA。用限制性核酸内切酶切割，产生大小适当的平头末端cDNA片段
（2）将检测cDNA分成均等的两份。分别接上接头1或接头2，接头有一长链和一短链组成的一段是平末端的双链cDNA分子。长链3’端与cDNA5’端相连。长链外侧序列与第一次PCR引物序列相同，内侧序列则与第二次PCR引物序列相同。此外，接头上含有T7启动子序列及内切酶识别位点。为以后将该片段插入克隆载体和测序提供便利。
（3）第一次差减杂交。
（4）第二次差减杂交
（5）第一次PCR反应
（6）第二次PCR反应
（7）差异片段的初步筛选
