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离子交换色谱的固定相表面含有(如SO3-、COO-、NH3 等)离子官能团，因此带有电荷。这种电荷被流动相中的相反电荷的离子中和。当样品进入色谱柱后，样品离子便与流动相离子相互竞争固定相表面的电荷位置，并因竞争力的差异使样品组分得到分离。
离子交换分离色谱的关键是要控制样品离子与流动相离子对固定相表面电荷位置的竞争作用。为得到最佳的分离条件，可控制以下几个方面的选择：
1)离子交换剂的类型。
2)流动相的pH。
3)流动相的离子强度。
4)流动相中配对离子的类型。
