1. 印迹膜制备 按常规方法完成SDS-PAGE和电转膜操作，适当的封闭非常重要。可以通过标记一抗或二抗的手段引入HRP，一般采用市售的HRP二抗交联物。仔细地淋洗对于降低背景非常重要，在与HRP交联物温育后，膜片更需仔细洗涤，所有步骤均在室温下完成。

2. 化学发光试剂的配置 在使用前等量混合a液和b液，混合后尽快使用。将膜片置混合液中于室温下振荡温育2分钟，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆盖全膜片。

3.蛋白信号显现

1). 用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸以吸去过量试剂。

2). 置膜片于二层保鲜膜之间，小心赶尽气泡。

3). 将膜片吸附蛋白面朝上，置于x光片盒中。

4). 于暗室中压上x光片。

5).根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果。显影冲洗。

6). 调节曝光时间，再次曝光显影。

4、膜的重复使用:

配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巯基乙醇的溶液，膜放入后，70?c振荡水浴30分钟。再用tbst或pbst缓冲液洗脱，最后用bsa(牛血清白蛋白)或牛奶封闭。

Chemiluminescent

非放射性发光系统，用于检测固定在膜上的蛋白，其敏感性达1-5pg。用x光片可快速地获得永久的硬拷贝结果。所含独特的底物足以维持12小时以上的发光，便于反复曝光操作，免疫印迹膜经抗体脱卸处理后可供再次抗体探查使用。适用于痕量蛋白或核酸检测。

2-8℃密封避光保存一年。

无特殊毒性，按普通化学品处理。如果不慎与眼、皮肤和衣物接触，请立刻用大量清水冲洗。

辣根过氧化酶使试剂中的发光物(luminol)氧化并发光，而试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。在免疫印迹中，将复杂的蛋白混合物经sds-page分离，并转移到固相膜上(如nc、pvdf)等，用于免疫学检测，经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接(标记一抗)或间接(标记二抗)反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，luminol发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此光可经x光胶片(放射自显影片)感光记录下来。

1. 试剂每个批号均独立优化，请不要混用或稀释试剂以免降低敏感性;

2. 加入一抗后膜不能再干燥;

3. 适当地封闭和洗涤膜片至关重要;

4. 使用前配置化学发光试剂，配置足够覆盖膜片即可，弃去使用过的混合试剂;

5. 使用干净取样头取用每种试剂;

6. 第一张片子建议曝光1分钟，观察结果后判断最佳曝光时间可从30秒至2小时不等;

7. 除了放射自显影片曝光和洗片处理外，所有步骤均不必在暗室中操作;

8. 膜片可经适当方法洗脱原有抗体，再次印迹使用，在此情况下，此试剂更为理想;

9. 因为它不象生色物质需要从膜片上清除底物。

10. nan3能抑制HRP活性，应避免使用nan3。