共聚焦显微技术是在荧光显 微分析技术的基础上发展起来的，利用荧光显微镜可以对生物样品发出的荧光进行观察和分析，但是荧光显微镜收集到的是样品的整体荧光，来自样品内不同部位的 荧光信号相互干扰。难以区分，无法获得准确的定位和定量信息。 共聚焦显微技术的出现很好地解决了这一问题，这一技术可以获取细胞内某个薄层面上的荧光信息，而该层以外的信号被消除掉，成像清晰程度大大提高；结合计算 机自动控制，可以对荧光信号的分布、强度和动态变化进行全方位的分析，得到丰富的信息。

与传统显微镜相比共聚焦显微镜可抑制图像的模糊，获得清晰的图像；具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片；增加侧向分辨率；由于点对点扫描去除了杂散光的影响。

共聚焦显微镜利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点

共聚焦原理

探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在 样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭 的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫 描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器 上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面的连续光切图像。

目前共聚焦的实现有两种方式：激光共聚焦和数字共聚焦。

这种共聚焦技术利用激光[3]作为激发光源，将激光聚焦于样品中的某一点，这样只有该点附近的区域有荧光，其他没有被激发的部位没有荧光，这一区域发出的荧光反射到光电倍增管，在光电倍增管前设有1 个计算机控制的可调节针孔， 保证只有被激发点发出的荧光才能到达光电管，而附近其他点所发出的荧光被挡在视野之外。采用计算机控制激光和针孔， 对细胞内的某一层面进行扫描，可以获得清晰的二维图像。

这一技术成像速度快、自动化程度高。但激光具有单色性，一种激光器只能发出某几个特定波长的激光，而荧光染料的种类很多，其激发光波长各不相同，这样在使用某种型号的激光器时，只有少数几种荧光染料可以使用， 而其他大多数的染料不能使用；目前同时配备数个不同激光器或多光子脉冲激光器的激光共聚焦系统的出现，虽然可以解决这一难题，但是设备结构复杂、价格昂贵，维护保养要求较高。

成像清晰

由于利用光学或数字技术消除了聚焦平面以外的荧光信号的干扰, 使我们要分析的区域内的图像清晰度提高, 得到更为准确的定位和定量信息。

连续片层扫描及图像重组

共聚焦显微镜在计算机的控制下可以对样品中的不同层面进行连续逐层扫描, 以获得各个层面的图像, 层面之间的间距可以达到0. 1微米甚至更小, 在图像获得后由计算机自动将这些图形重组为三维图像。与普通光学照相机获得的图像比较,共聚焦所得到的重组三维立体图形清晰度高、层次分明、立体感更强, 通过计算机软件处理, 可以对三维图形进行任何形式的旋转, 可以从任何角度进行观察, 还可以对细胞内的某个选定结构进行长度、体积的测量和计算, 在分析细胞内的空间结构和某些物质在细胞内的精确定位方面具有明显的优势, 这也是共聚焦显微技术诸多功能中应用最广泛的一种。

多标记技术

利用共聚焦系统可以同时对利用两种或三种不同的荧光染料分别标记了细胞的不同结构(如分别标记染色体和细胞骨架系 统) 的样品进行观察, 这样一次实验观察就可以获得细胞内不同结构的信息, 对不同结构组分的定位、相互联系方式进行研究。在最终获得的图像可以分开表示单个结构; 也可以将图片迭加在一起, 用不同颜色表示不同的结构, 更加直观, 这是普通荧光显微镜无法做到的。

活体观察

除了可以对固定标本的细胞进行观察外, 共聚焦显微技术还可以在不对细胞进行固定或其他损伤性处理的情况下进行观察, 获得活细胞内[5]的信息, 显示在活体情况下细胞内的真实结构和生理学特征。更为重要的是利用共聚焦显微镜可以跟踪自然状态下或受某种因素刺激后活细胞内的结构和生理过程随时间变化的情况, 得到准确而直观的动态变化资料, 为分析细胞内的生理生化反应提供直接的实验数据。

获得数量化信息

共聚焦显微技术不仅能够对细胞内荧光进行定位, 还可以对其进行定量分析, 获得二维或三维空间内分布在样品不同部位的荧光强度数值以及荧光强度在各种处理条件下的变化情况。量化信息的获得是研究活细胞内生理生化反应时重要的手 段, 而共聚焦显微技术在这一方面的优势是其他技术所无法达到的。

共聚焦显微技术的应用范围包括形态学观察与测量、生物学测量蛋白质功能检测与包括在光谱测量中的其它方面的应用。

其中该技术在形态学的观察与测量方面包括亚细胞器定位，如最简单的二维定位、定量及三维定位、图像重组等。

生物学测量方面可以分为动态与静态的生物学测量，在动态与静态水平都可以同时检测活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化(Mg2+ 、Na+ 、K+等)、自由基的动静态水平、线粒体膜电位的动静态变化及蛋白质的转位（不过静态测量时需用固定样品）。此外，动态测量还可以对药物进入细胞的动态过程进行定位分布及定量。

蛋白质功能检测[6]可分为蛋白荧光恢复的测量(FRAP)与FLIP、笼索解笼索的测量与动态/静态兼可的荧光能量共振转移(FRET)三种测量方式。