电镜标本制作过程中,人为地引起组织细胞发生不少变化,致使在电镜下看到的超微结构,已与其生活状态有相当差距,而且这些差距随放大倍率的增高而加大,因而对组织细胞的生理构造及病理变化所做出的解释难免有谬误之处。Heuser等〔1,2〕创立的急速冷冻深度蚀刻(quick-freezinganddeep-etching,简称QF-DE)技术可用于观察组织细胞接近生活状态的三维超微结构,被认为是电镜领域划时代的新技术。国内虽早有李向印等关于快速冷冻复型技术的报道 〔3〕,但之后未见进一步的研究报道。国外均用EikofD-3S以上新型冷冻蚀刻装置进行研究〔4,5〕,而这些装置价格昂贵,国内尚未引进。本文介绍QF-DE技术并探讨应用国内已有的EikofD-2A型冷冻蚀刻装置能否制成QF-DE复型膜。

取新鲜肾皮质组织切成2mm×2mm×4mm小块。

方法有:①化学性膜处理法,将组织块浸入0.02%~0.1%的皂角苷15~30min,皂角苷能溶解脂类物质,可引起细胞膜破坏,使细胞内可溶性蛋白流出。另外,由于皂角苷也溶解细胞内的膜性结构,因而此法仅适用于观察不含脂质的细胞骨架等结构。②物理性膜处理法,将注射器针头等锐器贴到玻璃片上,对组织进行研磨,破坏细胞膜,使细胞内可溶性蛋白流出。本法不破坏细胞内结构,适用于观察细胞内膜性结构。

低浓度戊二醛(0.125%~0.25%)短时间(15~30min)轻微固定以更好地保存超微结构(此步亦可省略),然后以10%甲醇冲洗30s,防止冷冻时冰晶形成。

用甘油将标本贴敷于标本托上,迅速置入异戊烷-丙烷混合液(-193℃)中冷冻。异戊烷-丙烷混合液的配制方法是,先将液氮盛于一较大容器中,然后将盛有异戊烷的玻璃杯放入液氮中冷却,再将丙烷吹入异戊烷中,丙烷液化而形成异戊烷-丙烷混合液。冷冻后迅速将标本移入液氮中,并用冷却后的手术刀割断组织。

将标本置入冷冻蚀刻装置中,在真空度-13300000~-133000000KPa、-95℃条件下蚀刻15~20min,使组织表层(10~20μm)的冰充分升华,显露出埋在冰中的微细构造。组织细胞含大量水分,在冷冻过程中形成均匀一致的冰(玻璃化状态),组织细胞的微细构造为这些冰所掩埋。在真空条件下,温度上升可除去冰,这一过程即蚀刻。蚀刻速度因温度而不同,-90℃为14nm/s,-110℃为0.02nm/s。以上述条件,蚀刻深度约10μm。蚀刻后的组织表面以37°角旋转喷镀白金,制取复型膜,再以90°角喷镀碳加固复型膜。

从冷冻蚀刻装置中取出标本,迅速在其表面涂以醋酸戊酯稀释的2%火棉胶,防止复型膜破裂。室温下充分干燥后将标本浮于家庭用漂白剂(次亚氯酸钠)中约1h,溶解掉复型膜以外的其它组织。然后将复型膜移至蒸馏水中,冲洗数次后载到铜网上。室温下干燥后浸入醋酸戊酯或丙酮中除去火棉胶。

自然干燥后透射电镜观察。

用卵白蛋白诱发大鼠免疫复合物性肾小球肾炎模型〔6,7〕,取模型组和对照组大鼠肾脏,按上述方法制取复型膜,透射电镜观察。结果如图1~6所示,用QF-DE技术所观察到的组织细胞的三维超微结构不仅清晰逼真,而且可以揭示一些普通电镜技术难以揭示的现象。应用EikofD-2A型冷冻蚀刻装置完全可以做出高质量的QF-DE复型膜。因此,在没有足够资金购买新型冷冻蚀刻装置前,应用国内现有的EikofD-2A型冷冻蚀刻装置探讨组织细胞接近生活状态的三维超微结构是可行的。

普通电镜标本制作过程存在的缺点可概括如下:①化学固定引起细胞内物质移动及微细构造的改变,特别是不可避免地引起以钠为主的电解质及金属离子的移动及流出;②化学固定引起组织结构变形,如细胞内的细胞骨架及许多可溶性蛋白质相互架桥;③脱水引起脂质等细胞内物质丢失;④包埋、聚合过程使本来含有多量水分的细胞陷于过干状态;⑤透射电镜观察需将本来直径约10μm的立体的细胞切成0.05~0.1μm的薄片,故电镜下所看到的不是三维结构而是二维结构;⑥醋酸铀和铅盐染色沉淀增加了人工产物。

QF-DE技术是将含有大量水分的组织细胞轻微固定,或新鲜标本不固定,在液氮中用纯铜块压迫促其迅速冷冻,或在异戊烷-丙烷混合液中迅速冷冻,使其从组织表面深约10~20μm范围内形成玻璃化状态。与以前的冷冻法相比,冷冻速度快,因而称之为急速冷冻。冷冻后的组织在高真空状态下,使温度上升至100℃左右,目的是将固态的水分绕过液态而迅速升华,组织内的冰得以消融,遂使细胞膜以及细胞内外的固有构造得以更清楚地暴露出来。这一使存在于细胞内外的冰在真空状态下充分升华的过程称为深度蚀刻。与冷冻蚀刻法相比,QF-DE法有如下特点:①不用或少用化学固定,因而减少人为引起的组织细胞超微结构的变化;②冷冻速度快,能捕捉到瞬间的形态学变化;③由于不使用防冻剂,蚀刻深,不仅能观察膜的疏水面,而且能观察亲水性的膜表面及细胞内外的三维超微结构。

QF-DE法是电镜领域新技术之一,可用于观察组织细胞接近生活状态的三维超微结构,分辨率高,尤其适用于观察细胞骨架和细胞外基质,具有广阔的应用前景。近年来,用QF-DE技术所进行的研究,获得了许多常规电镜所无法得到的超微结构新知识。迄今的研究多用于动物组织,期待今后用于人体组织,相信会得到许多有价值的资料。