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原生质体(protoplast):脱去全部细胞壁的细胞叫原生质体,是一生物工程学概念。原生质体是由质膜所包围的具有生活力的"裸露细胞"。
原生质体培养:对离体植物的原生质体进行培养,形成完整植株的培养技术。
主要来源:植物的叶片,根尖,花粉,愈伤组织细胞等。
原生质体的纯化方法:沉降法、漂浮法、界面法。
机械分离法:常用于分离藻类原生质体,采用渗透方法使细胞发生质壁分离,用刀把细胞壁切破,使原生质体流出。(手工操作难度大,得率低,费时费力)
酶解分离法:用酶(琼脂酶,果胶酶,纤维素酶等)将细胞壁分解。(条件温和,原生质体完整性好,活力高,得率高) 因此原生质体制备多采用酶解法,此法操作过程分为:取材消毒,酶解制备, 原生质体收集。
半透膜和原生质层有区别:半透膜 半透膜是一种只给某种分子或离子扩散进出的薄膜,对不同粒子的通过具有选择性的薄膜。例如细胞膜、膀胱膜、羊皮纸以及人工制的胶棉薄膜等。现代半透膜还用于多孔性壁(如无釉陶瓷)...
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是指用特殊方法脱去了植物细胞壁的、裸露的、 有生活力的原生质团。没有细胞壁,但具有活细胞的一切特征。
①无细胞壁障碍,可以方便地进行有关遗传操作,并可以对膜,细胞器等进行基础研究。
②具有全能性,并能进行人工培养发育成完整植株。
③原生质体适合进行诱导融合形成杂种细胞。
即检验所获得的原生质体是否是真正的原生质体
(1)低渗胀破法:把原生质体放入低渗透溶液中,在显微镜下观察原生质体从低渗溶液中吸水胀破的过程。如果是真正的原生质体,因为没有细胞壁,这样在胀破后留下的残迹应该是无形的。如果原生质体还带有部分细胞壁,则原生质体从无壁部分吸水向外膨胀直至胀破,破碎后留下的残迹仍保持半圆形的细胞壁。
(2)荧光染色法:将原生质体放入离心管中,加入0.7mol/L甘露醇配置的 0.05%~0.1%荧光增白剂溶液,染色5~10min,离心、洗涤除去多余的染料,在荧光显微镜下观察。绿色光显示纤维素的存在,发出红色光的是没有纤维素的真正的原生质体
检验原生质体是活细胞还是死细胞
染色法:
①二乙酸荧光素(FDA)法:FDA本来没有荧光,当其进入细胞后被脂酶分解为具有荧光的极性物,不能透过质膜,而是留在细胞内发出荧光。因此能发出荧光的是具有活性的原生质体。
②酚藏花红染料法:具有活力的原生质体吸收染料显红色;无活力的不能吸收染料而显示白色。
③伊文思蓝染色法:有活力的细胞不能吸收染料为无色;而没活力的细胞则能吸收染料显蓝色。
其他法:①胞质环流法②渗透压变化③氧电极法④形态观察法
经原生质体培养的植株再生一般经过细胞壁再生,细胞分裂成细胞团、愈伤组织(或胚状体)、植株再生这几个过程。
①细胞壁再生:原生质体在合适条件下短时间内开始膨胀,叶绿体重排,并开始合成新的细胞壁,进而由球形变成椭圆形。
②细胞分裂:不同的植物细胞分裂时间不同。为了细胞能持续分裂,应注意及时添加新鲜培养液。
③愈伤组织:细胞不断分裂形成细胞团,并进一步形成愈伤组织。一些植物由细胞系形成胚状体。愈伤组织诱导:在合适的培养基,通过调节生长素和细胞分裂素的比例。
④植株再生,诱发芽和根的生成。 诱导胚状体:在原生质体培养时直接诱发胚状体的生长,从而发育成完整植株。
主要有液体浅层培养法、液体悬滴培养、固体平板法、固液双层培养法(应用最广泛)、琼脂糖珠培养法
①植物原生质体是细胞无性系变异和突变体筛选的重要来源;
②植物原生质体是细胞融合工作的基础;
③植物原生质体是植物遗传工程的理想受体和遗传饰变的理想材料;
④在细胞生物学与遗传理论研究上的应用。
蝴蝶兰原生质体提取方法的优化
以蝴蝶兰自交品种NOⅡ的无菌苗叶片为试材,采用单因素试验和正交试验,比较不同酶的种类、酶液浓度、材料和酶液的比例、渗透压、酶解时间及纯化条件对原生质体产量和活性的影响,并用荧光显微镜观察去壁情况。结果表明:在同一种条件下1 g蝴蝶兰叶片加入10 mL酶解液中,酶解液含1.0%纤维素酶R-10,1.0%果胶酶,0.5 mol·L~(-1)甘露醇,酶解3 h,有活力的原生质体产量最高,其产量为1.3×10~5个·g~(-1),活性达81.90%。
柑桔属与九里香属的原生质体融合及植株再生
采用PEG(聚乙二醇)诱导原生质体融合,进行了Page桔柚(Citrus reticulata Blanco×C.grandis Osb.cv.Page)九里香(Murraya paniculate Jack.)的体细胞杂交,培养获得了40株再生植株,经细胞学检查和同工酶分析鉴定,确认有2株为Page桔柚九里香的体细胞杂种植株,它们均为四倍体(2n=4x=36),具有双亲综合的谷草转氨酶(GOT)
《植物组织培养技术》是教育部推荐使用的教材,是依据《2003-2007年教育振兴行动计划》和教育部《关于制定(2004-2007年职业教育教材开发编写计划)的通知》精神组织编写的。
《植物组织培养技术》内容包括绪论、实验室仪器设备和使用方法、植物组织培养工厂的设计、组织培养基本技术、植物快速繁殖技术、无病毒苗的培养、花药和花粉培养、细胞培养、原生质体培养和体细胞杂交、种质保存,以及常见园林植物的快速繁殖方法、实验与实训等。通过《植物组织培养技术》,可了解植物组织培养工厂的流程设计,熟悉组织培养实验室设备和使用方法,掌握植物组织培养的基本技术、快速繁殖与脱毒技术,以及南北方常见实用品种的组织培养技术。
《植物组织培养技术》适合高等、中等职业技术院校、大专函授、成人高校农林类专业使用,也是从事植物组织培养工作的人员职业培训教材和自学用书。
《普通高等教育“十三五”规划教材:植物组织培养(第2版)》全面系统地介绍了植物组织培养的概念、原理、方法与应用技术,分理论篇和应用篇,共18章。理论篇包括绪论、植物组织培养的基本原理、实验室的布局及设备、植物组织培养的基本技术、植物器官培养、植物组织培养、植物细胞培养、植物原生质体培养等内容,阐述了植物组织培养的基本概念、基本原理、基本方法与技术、历史、发展方向与新技术;应用篇,包括植物胚培养、植物离体快繁、人工种子、植物脱毒苗培育、植物体细胞无性系变异及筛选、次生代谢产物生产和生物转化、植物种质资源的离体保存、植物单倍体培养、体细胞杂交、植物遗传转化等内容,详细介绍了植物组织培养在农业、林业、工业、医药业等方面的应用方法与技术,全面地反映了国内外新研究成果与动态,并重点描述了75项经典或新的应用实例。
《普通高等教育“十三五”规划教材:植物组织培养(第2版)》概念准确,内容丰富,资料翔实,信息量大,技术方法详细具体,图文并茂,理论与实践并举,可作为植物生产类、草业科学类、森林资源类、环境生态类及生物科学类等各专业高年级本、专科生及研究生教材,也可供相关科研人员与生产者使用。
本书系统地论述了植物生物技术的理论和方法,既介绍了基本知识,也反映了该领域的最新研究进展。全书共17章,分三大部分。第一部分为植物组织和细胞培养的基本技术和方法,共7章,对离体操作的原理、植物组织和细胞培养、原生质体培养及融合、植物脱毒与快繁等方法和技术进行了系统描述;第二部分介绍了植物基因工程的原理和技术,共6章,包括基因克隆的方法、转化载体的构建、遗传转化技术、转基因检测、转基因植物的遗传及安全评价等;第三部分内容为植物分子标记及辅助选择应用,共4章,主要论述分子标记连锁图构建、植物基因组研究概况、分子标记辅助选择育种及其应用实例等。
本书是植物科学技术专业的教材,主要用于农林院校相关专业本科生、研究生教学。本书也是从事植物生物技术研究人员的一本有益参考书。