取当天配制的1.0%铁氰化钾溶液4.0ml，加3.5mol/L的氢氧化钠溶液制成100ml，于4h内使用。

精密称取维生素Bl对照品约25mg，溶于300ml的稀醇溶液(1→5)，用3mol/L盐酸溶液调节至pH4.0，加稀醇稀释成1000ml，作为贮备液。避光冷藏，每月配制一次。取贮备液适量，用0.2mol/L盐酸溶液逐步定量稀释至0.2µg/ml的溶液。

取供试品适量，用0.2mol/L盐酸溶液溶解制成100µg/ml的溶液(若供试品难溶，可在水浴上加热使溶解)，精密量取5ml，逐步定量稀释至0.2µg/ml的溶液。

取40ml具塞试管(或其他合适容器)3支或3支以上，各精密加入对照品溶液5ml，于其中2支(或2支以上)试管中迅速(1~2s内)加入氧化剂各3.0ml，在30s内再加入异丁醇20.0ml，密塞，剧烈振摇90s。于另一文试管中加3.5mol/L 氢氧化钠溶液3.0ml以代替氧化试剂，并照上述方法操作，作为空白。

另取3支或3支以上的相同试管，各精密加入供试品溶液5ml，照上述对照品溶液管的方法，同法处理。

于上述6支或6支以上试管中，各加入无水乙醇2ml，旋摇数秒钟，待分层后，取上层澄清的异丁醇液约10ml，置荧光计测定池内，测定其荧光强度(荧光计的输入和输出的最大波长分别为365nm和435nm)。