辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉(辅基)构成一种糖蛋白(含糖18%)。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
HRP分子量较小(40kDa)，标记物容易穿透入细胞内部;作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺(DAB)为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察;在pH3.5~12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min;用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性;溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化;氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。
凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物(供氢体)都可以用显色剂。供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。前者最常用的为3，3'二氨基联苯胺(3,3'diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法;反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物;这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查;此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别;易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种;但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。
用HRP标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。
HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4)还原成稳定的结合物。
[标记步骤]
(1)取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1%2，4而二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液0.1mL，室温(20℃±)下轻微搅拌作用1h。
(2)加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。
(3)加入1mL0.16mol/L乙二醇，室温(20℃±)下轻搅作用1 h，终止氧化反应。
(4)加入5mg抗体(Ig)，装入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液(无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g,蒸馏水加至1 000 mL)1 000 mL中，4℃透析过夜，更换3次。
(5)取出透析袋中液体(约3 mL)，加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4℃ 2h或过夜。
(6)加50%饱和硫酸铵(NH4)2SO4溶液(硫酸铵850g，蒸馏水加至1 000 mL，以30%氨水调pH7.2)6 mL沉淀结合物，置4℃30min后，3 000r/min离心30min，取深沉(SPA不需要进行此步)。
(7)将沉淀物溶于PBS(0.02M pH7.4)中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次。
(8)在结合物内加入BSA至蛋白浓度为10mg/ mL，或加等量60%甘油，测定工作效价后，小量分装(或冻干，不需加甘油)，低温保存备用。
戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白结合物。反应可在4-40℃温度范围，pH6.0~8.0 的缓冲溶液中进行，分为一步法和二步法，戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。
[标记步骤]
(1)取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温(20℃左右)反应结合18h。
(2)用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析过夜。
(3)将5mg抗体IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP溶液(10mg/mL)混合。
(4)加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液(调节pH至9.0~9.6)，4℃，电磁搅拌下结合24h。
(5)加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸(0.29g溶于10mL蒸馏水)，4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。
(6)装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析过夜，或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液，加入等量60%甘油，测工作效价后，小量分装，4℃或-20℃保存。
