PAGE为Polyacylamide Gel Electrophoresis的简写即聚丙烯酰胺凝胶电泳，是一种常用的分离技术。

1.聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(以后简称单体)在水溶液中聚合而成的亲水性高聚物，是一种透明而不溶于水并有韧性的凝胶。

2.制备凝胶时需要的原料是:丙烯酰胺，亚甲基双丙烯酰胺(双体，用作交联剂)o在水溶液中用催化剂引发聚合。常用的催化剂有:二甲氨基丙腈(DMAPN);过硫酸铵，四甲基乙二胺;过硫酸铵或加核黄素后用紫外光(波长 253.7毫微米)引发聚合。

3.聚合时丙烯酰胺分子通过加成反应形成长链，双体的作用是在长链之间形成交联，成为具有三维网状结构的凝胶(见图1)。所以在凝胶电泳中除了具有电泳的分离外还具有分子筛作用，从而增高了它的分辨能力。

4.聚合时，根据分离的需要，可以用改变单体溶液浓度或增减双体比例的办法制成孔度大小不同的凝胶。在分离血清蛋白时，我们采用的丙烯酰胺总浓度为6.5%，内含单体96%，双休4 5{刍(T一6.5，c一4%)。

5.聚合物分子中含有很多酰胺基，所以凝胶具有良好的亲水性。能在水中溶胀但不溶解。

SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳操作流程

1.将玻片装置搭建起来，加水静置，检查是否有渗漏。

2.配制分离胶 加入2玻片间，加时尽量减少气泡，由玻片一端连续、快速、均匀的注入，可适当摇晃，使得分离胶上界面尽量水平;加保护液(0.1% SDS)静置凝聚。加保护液时，枪头应均匀扫过玻片上沿，切不可由一端注入。

3.配制浓缩胶 待分离胶凝固后，去除保护液，依同样方法加入上层浓缩胶，并插入梳齿模具，静置。插入模具后，加少许浓缩胶，补平液面 。

4.配制电泳缓冲液，浓缩胶凝固后，玻片取下，放入电泳槽中，有凹陷玻片朝向内侧，并将玻片用夹子夹紧，在外侧玻片粘上凹槽指示薄片，取下梳齿，加入电泳缓冲液，平板内侧液面以刚没过凹槽上沿为宜。

5.样品处理 将待分析样品配制成合适的浓度或浓度梯度溶液，连同marker分装于Ep管中，并加入loading buffer ，100℃煮沸。此步可调至步骤3后做，一般4完成后不宜等待过长时间，最好立即加样、通电。

6.将样品液依次加入梳齿形胶孔中，每孔上样量10ul。

7.接通电源，设为恒流10 mA，待样品跑至分离胶界面后，调整电流为15 mA。

8.胶跑完后，固定(0.5h~)、染色(1.5h~)、脱色。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。

此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。

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