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SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后,HCL解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成以稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。
此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。
SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳操作流程
1.将玻片装置搭建起来,加水静置,检查是否有渗漏。
2.配制分离胶 加入2玻片间,加时尽量减少气泡,由玻片一端连续、快速、均匀的注入,可适当摇晃,使得分离胶上界面尽量水平;加保护液(0.1% SDS)静置凝聚。加保护液时,枪头应均匀扫过玻片上沿,切不可由一端注入。
3.配制浓缩胶 待分离胶凝固后,去除保护液,依同样方法加入上层浓缩胶,并插入梳齿模具,静置。插入模具后,加少许浓缩胶,补平液面 。
4.配制电泳缓冲液,浓缩胶凝固后,玻片取下,放入电泳槽中,有凹陷玻片朝向内侧,并将玻片用夹子夹紧,在外侧玻片粘上凹槽指示薄片,取下梳齿,加入电泳缓冲液,平板内侧液面以刚没过凹槽上沿为宜。
5.样品处理 将待分析样品配制成合适的浓度或浓度梯度溶液,连同marker分装于Ep管中,并加入loading buffer ,100℃煮沸。此步可调至步骤3后做,一般4完成后不宜等待过长时间,最好立即加样、通电。
6.将样品液依次加入梳齿形胶孔中,每孔上样量10ul。
7.接通电源,设为恒流10 mA,待样品跑至分离胶界面后,调整电流为15 mA。
8.胶跑完后,固定(0.5h~)、染色(1.5h~)、脱色。
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1.聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(以后简称单体)在水溶液中聚合而成的亲水性高聚物,是一种透明而不溶于水并有韧性的凝胶。
2.制备凝胶时需要的原料是:丙烯酰胺,亚甲基双丙烯酰胺(双体,用作交联剂)o在水溶液中用催化剂引发聚合。常用的催化剂有:二甲氨基丙腈(DMAPN);过硫酸铵,四甲基乙二胺;过硫酸铵或加核黄素后用紫外光(波长 253.7毫微米)引发聚合。
3.聚合时丙烯酰胺分子通过加成反应形成长链,双体的作用是在长链之间形成交联,成为具有三维网状结构的凝胶(见图1)。所以在凝胶电泳中除了具有电泳的分离外还具有分子筛作用,从而增高了它的分辨能力。
4.聚合时,根据分离的需要,可以用改变单体溶液浓度或增减双体比例的办法制成孔度大小不同的凝胶。在分离血清蛋白时,我们采用的丙烯酰胺总浓度为6.5%,内含单体96%,双休4 5{刍(T一6.5,c一4%)。
5.聚合物分子中含有很多酰胺基,所以凝胶具有良好的亲水性。能在水中溶胀但不溶解。
PAGE为Polyacylamide Gel Electrophoresis的简写即聚丙烯酰胺凝胶电泳,是一种常用的分离技术。
SDS-PAGE操作方法要点
1 SDS-PAGE教程 1 SDS-PAGE 原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS(十二烷基硫酸钠) , SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合 SDS 的量几乎总是与多肽的分子 量成正比而与其序列无关,因此 SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽 的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与 1.4 g 去污剂结合。当分子量在 15 KDa 到 200 KDa 之间时, 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系, 符合下式: log MW = K – bX,式中: MW 为分子量, X 为迁移率, k、b 均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的 迁移率对分子量对数作图, 可获得一条标准曲线, 未知蛋白质在相同条件下进行电泳, 根据 它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS-PAGE [Laemmli 法 ] 这种
家装电路施工图解(page15)
家装电路(弱电)设计 装修的第一道工序就是”布线”。在我们装修居室的过程中,常常会忽略对电源 布线的全面考虑,因而造成布线不合理或漏布现象;而且随着经济的高速发展,原有 建设施工中的电源布线也远远不适应人们的需求。我在这里对家装中的电路布线提出 了一些建议,供大家在装修时参考。首先提醒大家的是,根据用电负荷的实际情况和 可能添置的设备负荷,选择电源线时,一定要选择国标线,以免造成超负荷而引起的 联线、短路或毁坏设备,在选择电气元件时,千万不能以次充好,以免造成事故。电 路改造涉及到空间的定位,还要开槽,所以要提前进行。严禁将导线直接埋入抹灰层, 导线在线管中严禁有接头,同时对使用的线管( PVC阻燃管或铁管)进行严格检查, 要符合国家标准,对管路铺设遵循“安全、方便、经济、客观”的原则。与此同时, 对特殊用电回路,例如:空调、整体浴室、速热式电热水器等,建议用户在购买时, 先自检是否有保护
mmap() 必须以PAGE_SIZE为单位进行映射,而内存也只能以页为单位进行映射,若要映射非PAGE_SIZE整数倍的地址范围,要先进行内存对齐,强行以PAGE_SIZE的倍数大小进行映射。
PAGE 006——TEXT 01 SPATIAL SIGNS ON
THE RELATIONSHIP BETWEEN ARCHITECTURE
AND THE DESIGN OF COMMUNICATION MEDIA
Philipp Meuser, Chen Wu
PAGE 018——TEXT 02 SAYING FAREWELL TO
THE WHEELCHAIR RAMP A PLEA FOR MORE
FRANKNESS IN BARRIER-FREE ARCHITECTURE
AND PLANNING
Philipp Meuser, Chen Wu
PAGE 032——TEXT 03 DISABILITIES AND
DISEASES SELECTED PLANNING REQUIREMENTS
Jennifer Tobolla
PAGE 038——BEST PRACTICE DESIGN MANUAL
TEN SPATIAL SITUATIONS AS EXAMPLES OF
BARRIER FREEDOM
Jennifer Tobolla
PAGE 112——PROJECTS
Philipp Meuser, Daniela Pogade
PAGE 412——INDEX 2100433B
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